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small521

银虫 (小有名气)


[交流] 同尾酶连接效率问题,求助

我有一个已经连接上载体的大片段,为xhoI连接,我的目的载体上面没有xhoI这个位点,但是有SalI,我打算利用这个同尾酶进行连接,不过因为载体自连,至今也没有筛到阳性,不知有没有做过同尾酶连接的大师帮我看看,我这么做有没有问题,还想问问这样的同尾酶连接有没有连上的可能,效率高不高?

还有,我是大片段连接,片段约12k,载体5k,连接起来比较费劲,不过前人已经有连接的成功案例,只是人家是双酶切,和我这有些不同,还有没有做过的高人指点一二,谢了
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gaohuihui

铁杆木虫 (著名写手)


★ ★ ★ ★
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small521: 金币+1 2013-11-05 16:05:33
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-05 18:15:30
XhoI  SalI同尾酶很好连接的, 载体自连是你载体去磷效果不好啊
2楼2013-11-05 16:00:41
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small521

银虫 (小有名气)


引用回帖:
2楼: Originally posted by gaohuihui at 2013-11-05 16:00:41
XhoI  SalI同尾酶很好连接的, 载体自连是你载体去磷效果不好啊

我没有去磷酸化,因为我师兄说去了效果也不好,自连也会很多,而且会影响非自连的效率,那如果连接效率高的话那我就放心筛了,谢谢了
3楼2013-11-05 16:05:10
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)


★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-06 10:24:24
small521: 金币+1 2013-11-07 13:13:18
去磷酸化后一般载体的自连可以降低到接近0。双酶切可以不用,单酶切的话一般是要取磷酸化的,否则自连的概率太高了。
4楼2013-11-06 07:55:44
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