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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切及构建载体问题
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doughtiness

新虫 (小有名气)

[交流] 酶切及构建载体问题 已有8人参与

大家好，请教大家个问题。以目的基因为模板，设计含有酶切位点（Kpnl and Xbal）的上、下游引物，进行PCR。将PCR产物克隆连接到PMD18-T，后来发现PMD18-T上同时也含有那两个酶切位点（Kpnl and Xbal），这样会影响将目的基因切下来的效率吗？我最终的目的是：要把目的基因插入到表达载体pPICZ中。
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1楼 2013-07-01 10:41:01
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

kx444555

至尊木虫 (正式写手)
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-07-01 11:15:34
看看两同样的酶切位点离点远不远，超过50BP的话跑胶还是可以看出来的，还有理论上酶切切完外面的酶切位点还会继续切里边的酶切位点的，酶适当多加一点
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星陈代谢
2楼2013-07-01 10:47:41
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chijing0225

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-02 02:38:34
影响不大，你可以适当延长酶切时间，构建好的载体要再送测序确定一下是不是只有你的目的条带
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3楼2013-07-01 13:47:14
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-07-02 02:38:43
问题不大，保证酶切充分的话回收的目的片段不会带多余的序列。话说回来了，既然设计了酶切位点，为什么不直接连入表达载体呢。
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4楼2013-07-02 00:46:31
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doughtiness

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-02 00:46:31
问题不大，保证酶切充分的话回收的目的片段不会带多余的序列。话说回来了，既然设计了酶切位点，为什么不直接连入表达载体呢。

为了省得每次都PCR,连到T载体上每次抽提质粒进行酶切就可以得到目的基因了，这样较稳定些吧。PCR出来的目的基因1100bp稳定不？接下来我都试试看吧，将PCR产物和目的基因进行酶切后，直接连接
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5楼2013-07-02 15:40:53
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doughtiness

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by chijing0225 at 2013-07-01 13:47:14
影响不大，你可以适当延长酶切时间，构建好的载体要再送测序确定一下是不是只有你的目的条带

一般的酶切时间是3个小时吧，若超过了，会不会乱切啊？
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6楼2013-07-02 15:41:34
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doughtiness

新虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by kx444555 at 2013-07-01 10:47:41
看看两同样的酶切位点离点远不远，超过50BP的话跑胶还是可以看出来的，还有理论上酶切切完外面的酶切位点还会继续切里边的酶切位点的，酶适当多加一点

酶里面含有甘油，加多了会不会影响酶切效率啊！您建议的酶切体系是多少啊？
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7楼2013-07-02 15:43:00
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kx444555

至尊木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 热心的斑斑 2013-07-03 02:13:47
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7楼: Originally posted by doughtiness at 2013-07-02 15:43:00
酶里面含有甘油，加多了会不会影响酶切效率啊！您建议的酶切体系是多少啊？...

不会影响，其实我们酶切没有固定体系的，只要酶切位点正确，缓冲液的终浓度正确，酶加多加少都不会影响后续连接
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星陈代谢
8楼2013-07-02 15:50:55
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doughtiness

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-02 23:43:24
TA克隆是为了方便直接克隆PCR产物的，通过T载体，可以不用在引物上特别设计酶切位点，PCR时引物的特异性比较好。即使做了TA克隆，还是要挑单克隆鉴定、测序的。如果你设计了酶切位点，用PCR产物酶切与表达载体连接 ...

哦，直接用PCR产物酶切，酶切位点就在目的基因的边缘，会不会影响酶切效率不好切啊？
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10楼2013-07-03 10:05:03
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-07-03 02:13:59
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5楼: Originally posted by doughtiness at 2013-07-02 15:40:53
为了省得每次都PCR,连到T载体上每次抽提质粒进行酶切就可以得到目的基因了，这样较稳定些吧。PCR出来的目的基因1100bp稳定不？接下来我都试试看吧，将PCR产物和目的基因进行酶切后，直接连接...

TA克隆是为了方便直接克隆PCR产物的，通过T载体，可以不用在引物上特别设计酶切位点，PCR时引物的特异性比较好。即使做了TA克隆，还是要挑单克隆鉴定、测序的。如果你设计了酶切位点，用PCR产物酶切与表达载体连接，可以省一步酶切连接。我觉得这两个方法在难易程度上没什么区别，选用哪种一般只是看个人喜好，我觉得没必要混起来用的。
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9楼2013-07-02 23:43:24
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