应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切及构建载体问题
271/3返回列表123下一页
查看: 2899  |  回复: 26
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

doughtiness

新虫 (小有名气)

[交流] 酶切及构建载体问题 已有8人参与

大家好，请教大家个问题。以目的基因为模板，设计含有酶切位点（Kpnl and Xbal）的上、下游引物，进行PCR。将PCR产物克隆连接到PMD18-T，后来发现PMD18-T上同时也含有那两个酶切位点（Kpnl and Xbal），这样会影响将目的基因切下来的效率吗？我最终的目的是：要把目的基因插入到表达载体pPICZ中。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

科技

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-07-01 10:41:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

kx444555

至尊木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-07-01 11:15:34
看看两同样的酶切位点离点远不远，超过50BP的话跑胶还是可以看出来的，还有理论上酶切切完外面的酶切位点还会继续切里边的酶切位点的，酶适当多加一点
赞一下(1人) 回复此楼
星陈代谢
2楼2013-07-01 10:47:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chijing0225

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-02 02:38:34
影响不大，你可以适当延长酶切时间，构建好的载体要再送测序确定一下是不是只有你的目的条带
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2013-07-01 13:47:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-07-02 02:38:43
问题不大，保证酶切充分的话回收的目的片段不会带多余的序列。话说回来了，既然设计了酶切位点，为什么不直接连入表达载体呢。
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2013-07-02 00:46:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

doughtiness

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-02 00:46:31
问题不大，保证酶切充分的话回收的目的片段不会带多余的序列。话说回来了，既然设计了酶切位点，为什么不直接连入表达载体呢。

为了省得每次都PCR,连到T载体上每次抽提质粒进行酶切就可以得到目的基因了，这样较稳定些吧。PCR出来的目的基因1100bp稳定不？接下来我都试试看吧，将PCR产物和目的基因进行酶切后，直接连接
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2013-07-02 15:40:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

doughtiness

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by chijing0225 at 2013-07-01 13:47:14
影响不大，你可以适当延长酶切时间，构建好的载体要再送测序确定一下是不是只有你的目的条带

一般的酶切时间是3个小时吧，若超过了，会不会乱切啊？
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2013-07-02 15:41:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

doughtiness

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kx444555 at 2013-07-01 10:47:41
看看两同样的酶切位点离点远不远，超过50BP的话跑胶还是可以看出来的，还有理论上酶切切完外面的酶切位点还会继续切里边的酶切位点的，酶适当多加一点

酶里面含有甘油，加多了会不会影响酶切效率啊！您建议的酶切体系是多少啊？
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2013-07-02 15:43:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kx444555

至尊木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 热心的斑斑 2013-07-03 02:13:47
引用回帖:
7楼: Originally posted by doughtiness at 2013-07-02 15:43:00
酶里面含有甘油，加多了会不会影响酶切效率啊！您建议的酶切体系是多少啊？...

不会影响，其实我们酶切没有固定体系的，只要酶切位点正确，缓冲液的终浓度正确，酶加多加少都不会影响后续连接
赞一下(1人) 回复此楼
星陈代谢
8楼2013-07-02 15:50:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

doughtiness

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-02 23:43:24
TA克隆是为了方便直接克隆PCR产物的，通过T载体，可以不用在引物上特别设计酶切位点，PCR时引物的特异性比较好。即使做了TA克隆，还是要挑单克隆鉴定、测序的。如果你设计了酶切位点，用PCR产物酶切与表达载体连接 ...

哦，直接用PCR产物酶切，酶切位点就在目的基因的边缘，会不会影响酶切效率不好切啊？
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2013-07-03 10:05:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-07-03 02:13:59
引用回帖:
5楼: Originally posted by doughtiness at 2013-07-02 15:40:53
为了省得每次都PCR,连到T载体上每次抽提质粒进行酶切就可以得到目的基因了，这样较稳定些吧。PCR出来的目的基因1100bp稳定不？接下来我都试试看吧，将PCR产物和目的基因进行酶切后，直接连接...

TA克隆是为了方便直接克隆PCR产物的，通过T载体，可以不用在引物上特别设计酶切位点，PCR时引物的特异性比较好。即使做了TA克隆，还是要挑单克隆鉴定、测序的。如果你设计了酶切位点，用PCR产物酶切与表达载体连接，可以省一步酶切连接。我觉得这两个方法在难易程度上没什么区别，选用哪种一般只是看个人喜好，我觉得没必要混起来用的。
赞一下 回复此楼
9楼2013-07-02 23:43:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 doughtiness 的主题更新
271/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +5 zju2000 2026-08-16 5/250 2026-08-16 23:23 by Haru815
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +32 医学老男孩 2026-08-13 74/3700 2026-08-16 21:05 by 医学老男孩
[论文投稿] 岩土工程学报什么时候才能终审完呐 25+3 yeager111 2026-08-10 4/200 2026-08-16 20:42 by tfang
[基金申请] 2027广东省杰青 +3 奶牛小黑 2026-08-15 6/300 2026-08-16 20:07 by 奶牛小黑
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？ +9 Ldrop2023 2026-08-13 9/450 2026-08-16 13:24 by wukun_007
[基金申请] 有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验） +10 majunge000 2026-08-11 12/600 2026-08-16 08:18 by xli1984
[精细化工] 招聘 金属平磨液，抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
[基金申请] filecode=后面第一个是大写字母 +6 wangze12014 2026-08-14 7/350 2026-08-15 20:12 by gltch
[基金申请] filecode +8 cratir 2026-08-14 12/600 2026-08-15 18:08 by zyfgau
[基金申请] 小木虫上这么多卖论文的，真有人买论文么？感觉没必要啊 +12 Tide man 2026-08-10 13/650 2026-08-15 16:34 by 氺木
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果？ +4 yuleib84 2026-08-11 4/200 2026-08-14 23:05 by lfy8008
[基金申请] 奇怪，两个人的filecode固定段从头到尾一模一样 +8 布布和一二 2026-08-10 11/550 2026-08-14 14:58 by Equinoxhua
[硕博家园] 读博的好处 +4 lnee 2026-08-11 4/200 2026-08-14 10:20 by ahsoarli
[基金申请] 静等基金结果 +8 gjjjzhong 2026-08-10 21/1050 2026-08-13 17:56 by 且听虎啸
[基金申请] 重要来源：本周末出结果 +10 瞬息宇宙 2026-08-12 10/500 2026-08-13 15:46 by likettle
[基金申请] 帮忙看看fileCode +7 wwncly 2026-08-10 13/650 2026-08-11 19:36 by 冰心玉壶晴
[基金申请] 为什么网上很多人说本周 12号出结果 +6 瞬息宇宙 2026-08-10 7/350 2026-08-11 19:25 by Tide man
[基金申请] 确定了，国自然21号放榜 +6 布布和一二 2026-08-10 7/350 2026-08-10 19:15 by 2000zf36392
[基金申请] 国自然结果 +4 Vierhys 2026-08-10 8/400 2026-08-10 15:06 by Vierhys
[基金申请] 据悉今年马上要出结果了 +7 瞬息宇宙 2026-08-10 8/400 2026-08-10 12:42 by Vivilian
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭