应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切及构建载体问题
272/3返回列表上一页123下一页
查看: 2461  |  回复: 26
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

zhouking8758

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-07-04 03:01:17
引用回帖:
10楼: Originally posted by doughtiness at 2013-07-03 10:05:03
哦，直接用PCR产物酶切，酶切位点就在目的基因的边缘，会不会影响酶切效率不好切啊？...

PCR产物直接酶切，是需要在引物的5‘段加上至少4个碱基的（GGGG，GCGC等），这样来保证酶能识别和剪切。
另外，在酶切过程中，不要加过量的酶，说明书中有说甘油过量是能降低酶活性的。
其实，一般的酶切效率都很高，一个小时完全足够。当然，酶切时间过长也没影响。
赞一下 回复此楼
11楼2013-07-03 10:45:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-07-04 03:01:29
引用回帖:
10楼: Originally posted by doughtiness at 2013-07-03 10:05:03
哦，直接用PCR产物酶切，酶切位点就在目的基因的边缘，会不会影响酶切效率不好切啊？...

一般有加保护碱基。酶切位点在末端的确会在一定程度上影响酶切效率，这还要看你用的是哪种限制酶。这些是设计带酶切位点的引物时要考虑的问题。
赞一下 回复此楼
12楼2013-07-03 23:09:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

f853012205

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
用PMD19 simple  那个载体没有酶切位点  我现在也想把我的目的基因连接到载体上，然后再切下来（我的也是pPICZαA 连接不得基因  可就是连不上  我做一个月了）
赞一下 回复此楼
13楼2013-07-05 10:42:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

doughtiness

新虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by f853012205 at 2013-07-05 10:42:27
用PMD19 simple  那个载体没有酶切位点  我现在也想把我的目的基因连接到载体上，然后再切下来（我的也是pPICZαA 连接不得基因  可就是连不上  我做一个月了）

我做快两个月了
回复此楼
14楼2013-07-06 15:55:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

doughtiness

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-03 23:09:30
一般有加保护碱基。酶切位点在末端的确会在一定程度上影响酶切效率，这还要看你用的是哪种限制酶。这些是设计带酶切位点的引物时要考虑的问题。...

我设计引物时酶切位点加了两个保护碱基，是不是加太少了啊？
赞一下 回复此楼
15楼2013-07-06 15:59:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

doughtiness

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-03 23:09:30
一般有加保护碱基。酶切位点在末端的确会在一定程度上影响酶切效率，这还要看你用的是哪种限制酶。这些是设计带酶切位点的引物时要考虑的问题。...

我用的是Kpnl 和 Xbal
赞一下 回复此楼
16楼2013-07-06 16:00:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

doughtiness

新虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by zhouking8758 at 2013-07-03 10:45:52
PCR产物直接酶切，是需要在引物的5‘段加上至少4个碱基的（GGGG，GCGC等），这样来保证酶能识别和剪切。
另外，在酶切过程中，不要加过量的酶，说明书中有说甘油过量是能降低酶活性的。
其实，一般的酶切效率都很 ...

可惜我的引物都已经设计好了，5‘端只有两个碱基，呜呜……这样PCR产物胶回收完，直接酶切会效果不佳吗？酶切时间长达7个小时也不可以吗？
赞一下 回复此楼
17楼2013-07-06 16:01:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhouking8758

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
17楼: Originally posted by doughtiness at 2013-07-06 16:01:47
可惜我的引物都已经设计好了，5‘端只有两个碱基，呜呜……这样PCR产物胶回收完，直接酶切会效果不佳吗？酶切时间长达7个小时也不可以吗？...

这个我没有试过。不过应该会影响酶的结合的。
楼主可以经过TA克隆测序后再酶切也一样的啊。
赞一下 回复此楼
18楼2013-07-06 23:45:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
16楼: Originally posted by doughtiness at 2013-07-06 16:00:07
我用的是Kpnl 和 Xbal...

你的运气不错，这两个酶在5'加两个保护碱基的切割率超过90%。
赞一下 回复此楼
19楼2013-07-07 01:17:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
15楼: Originally posted by doughtiness at 2013-07-06 15:59:41
我设计引物时酶切位点加了两个保护碱基，是不是加太少了啊？...

一般是要多加几个的，不过你选的这两个酶可以只加两个。
赞一下 回复此楼
20楼2013-07-07 01:18:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 doughtiness 的主题更新
272/3返回列表上一页123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭