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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切及构建载体问题
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zhouking8758

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-07-04 03:01:17
引用回帖:
10楼: Originally posted by doughtiness at 2013-07-03 10:05:03
哦，直接用PCR产物酶切，酶切位点就在目的基因的边缘，会不会影响酶切效率不好切啊？...

PCR产物直接酶切，是需要在引物的5‘段加上至少4个碱基的（GGGG，GCGC等），这样来保证酶能识别和剪切。
另外，在酶切过程中，不要加过量的酶，说明书中有说甘油过量是能降低酶活性的。
其实，一般的酶切效率都很高，一个小时完全足够。当然，酶切时间过长也没影响。
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11楼2013-07-03 10:45:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-07-04 03:01:29
引用回帖:
10楼: Originally posted by doughtiness at 2013-07-03 10:05:03
哦，直接用PCR产物酶切，酶切位点就在目的基因的边缘，会不会影响酶切效率不好切啊？...

一般有加保护碱基。酶切位点在末端的确会在一定程度上影响酶切效率，这还要看你用的是哪种限制酶。这些是设计带酶切位点的引物时要考虑的问题。
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12楼2013-07-03 23:09:30
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f853012205

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
用PMD19 simple  那个载体没有酶切位点  我现在也想把我的目的基因连接到载体上，然后再切下来（我的也是pPICZαA 连接不得基因  可就是连不上  我做一个月了）
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13楼2013-07-05 10:42:27
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doughtiness

新虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by f853012205 at 2013-07-05 10:42:27
用PMD19 simple  那个载体没有酶切位点  我现在也想把我的目的基因连接到载体上，然后再切下来（我的也是pPICZαA 连接不得基因  可就是连不上  我做一个月了）

我做快两个月了
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14楼2013-07-06 15:55:36
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doughtiness

新虫 (小有名气)
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12楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-03 23:09:30
一般有加保护碱基。酶切位点在末端的确会在一定程度上影响酶切效率，这还要看你用的是哪种限制酶。这些是设计带酶切位点的引物时要考虑的问题。...

我设计引物时酶切位点加了两个保护碱基，是不是加太少了啊？
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15楼2013-07-06 15:59:41
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doughtiness

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-03 23:09:30
一般有加保护碱基。酶切位点在末端的确会在一定程度上影响酶切效率，这还要看你用的是哪种限制酶。这些是设计带酶切位点的引物时要考虑的问题。...

我用的是Kpnl 和 Xbal
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16楼2013-07-06 16:00:07
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doughtiness

新虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by zhouking8758 at 2013-07-03 10:45:52
PCR产物直接酶切，是需要在引物的5‘段加上至少4个碱基的（GGGG，GCGC等），这样来保证酶能识别和剪切。
另外，在酶切过程中，不要加过量的酶，说明书中有说甘油过量是能降低酶活性的。
其实，一般的酶切效率都很 ...

可惜我的引物都已经设计好了，5‘端只有两个碱基，呜呜……这样PCR产物胶回收完，直接酶切会效果不佳吗？酶切时间长达7个小时也不可以吗？
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17楼2013-07-06 16:01:47
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zhouking8758

木虫 (正式写手)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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17楼: Originally posted by doughtiness at 2013-07-06 16:01:47
可惜我的引物都已经设计好了，5‘端只有两个碱基，呜呜……这样PCR产物胶回收完，直接酶切会效果不佳吗？酶切时间长达7个小时也不可以吗？...

这个我没有试过。不过应该会影响酶的结合的。
楼主可以经过TA克隆测序后再酶切也一样的啊。
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18楼2013-07-06 23:45:58
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
16楼: Originally posted by doughtiness at 2013-07-06 16:00:07
我用的是Kpnl 和 Xbal...

你的运气不错，这两个酶在5'加两个保护碱基的切割率超过90%。
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19楼2013-07-07 01:17:43
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
15楼: Originally posted by doughtiness at 2013-07-06 15:59:41
我设计引物时酶切位点加了两个保护碱基，是不是加太少了啊？...

一般是要多加几个的，不过你选的这两个酶可以只加两个。
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20楼2013-07-07 01:18:42
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