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doughtiness

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[交流] 酶切及构建载体问题已有8人参与

大家好，请教大家个问题。以目的基因为模板，设计含有酶切位点（Kpnl and Xbal）的上、下游引物，进行PCR。将PCR产物克隆连接到PMD18-T，后来发现PMD18-T上同时也含有那两个酶切位点（Kpnl and Xbal），这样会影响将目的基因切下来的效率吗？我最终的目的是：要把目的基因插入到表达载体pPICZ中。

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1楼 2013-07-01 10:41:01

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doughtiness

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引用回帖:

11楼: Originally posted by zhouking8758 at 2013-07-03 10:45:52
PCR产物直接酶切，是需要在引物的5‘段加上至少4个碱基的（GGGG，GCGC等），这样来保证酶能识别和剪切。
另外，在酶切过程中，不要加过量的酶，说明书中有说甘油过量是能降低酶活性的。
其实，一般的酶切效率都很 ...

可惜我的引物都已经设计好了，5‘端只有两个碱基，呜呜……这样PCR产物胶回收完，直接酶切会效果不佳吗？酶切时间长达7个小时也不可以吗？