应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 同尾酶酶切及连接
71/1返回列表
查看: 3402  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

myeagle

银虫 (小有名气)

[求助] 同尾酶酶切及连接 已有1人参与

各位高手，我是做真菌的，一个敲除质粒的下游的多克隆酶切位点是Spe1和Xba1这两个同尾酶，目的片段连上去之后做菌落PCR验证片段已经连上，但是提质粒酶切总是切不开，这说明了片段的方向连反造成了新的酶切位点的产生，但是我们已经挑了100个转化子了，按道理来说连正跟反的几率是1:1，但是总该有方向正确的吧，我接下来该怎么做，求高手指点
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-04-28 14:38:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-04-29 17:08:25
两个酶一起用的酶切效率怎么样，高不高。
通用的缓冲液是否用对啊？
赞一下 回复此楼
未来不是梦
2楼2012-04-28 15:22:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

myeagle

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-04-28 15:22:31:
两个酶一起用的酶切效率怎么样，高不高。
通用的缓冲液是否用对啊？

buffer 是10*M buffer，双酶切效率还挺好
赞一下 回复此楼
3楼2012-04-28 18:40:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

单酶切试过吗？能切开吗？
赞一下 回复此楼
未来不是梦
4楼2012-04-28 19:45:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

myeagle

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-04-28 19:45:04:
单酶切试过吗？能切开吗？

单酶切也不能切开，可能是反向连接形成了新的酶切位点，我想知道的是同尾酶酶切之后的连接怎么调整外源DNA片段的方向。
赞一下 回复此楼
5楼2012-04-28 21:19:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王家大成

木虫 (正式写手)

囧囧小虫

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
在大肠杆菌中复制质粒后，Xba1酶切位点有可能甲基化，导致即便连接方向正确，也不好单酶切验证。
赞一下(1人) 回复此楼
一念起，万水千山；一念灭，沧海桑田！
6楼2012-04-29 17:01:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fMssop

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

单酶切试试吧，曾经我也试过同尾酶连接，简直就是自虐。单酶切效率反而比同尾酶效率高，结过也更踏实一点，妳要是不死心，就挑几个送去测序，看看是否正确连接
赞一下 回复此楼
7楼2015-07-17 16:28:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 myeagle 的主题更新
71/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭