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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 同尾酶酶切及连接
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myeagle

银虫 (小有名气)

[求助] 同尾酶酶切及连接 已有1人参与

各位高手，我是做真菌的，一个敲除质粒的下游的多克隆酶切位点是Spe1和Xba1这两个同尾酶，目的片段连上去之后做菌落PCR验证片段已经连上，但是提质粒酶切总是切不开，这说明了片段的方向连反造成了新的酶切位点的产生，但是我们已经挑了100个转化子了，按道理来说连正跟反的几率是1:1，但是总该有方向正确的吧，我接下来该怎么做，求高手指点
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1楼 2012-04-28 14:38:32
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张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-04-29 17:08:25
两个酶一起用的酶切效率怎么样，高不高。
通用的缓冲液是否用对啊？
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未来不是梦
2楼2012-04-28 15:22:31
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myeagle

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-04-28 15:22:31:
两个酶一起用的酶切效率怎么样，高不高。
通用的缓冲液是否用对啊？

buffer 是10*M buffer，双酶切效率还挺好
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3楼2012-04-28 18:40:49
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张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

单酶切试过吗？能切开吗？
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未来不是梦
4楼2012-04-28 19:45:04
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myeagle

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-04-28 19:45:04:
单酶切试过吗？能切开吗？

单酶切也不能切开，可能是反向连接形成了新的酶切位点，我想知道的是同尾酶酶切之后的连接怎么调整外源DNA片段的方向。
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5楼2012-04-28 21:19:43
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王家大成

木虫 (正式写手)

囧囧小虫

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
在大肠杆菌中复制质粒后，Xba1酶切位点有可能甲基化，导致即便连接方向正确，也不好单酶切验证。
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一念起，万水千山；一念灭，沧海桑田！
6楼2012-04-29 17:01:34
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fMssop

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

单酶切试试吧，曾经我也试过同尾酶连接，简直就是自虐。单酶切效率反而比同尾酶效率高，结过也更踏实一点，妳要是不死心，就挑几个送去测序，看看是否正确连接
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7楼2015-07-17 16:28:39
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