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wendell13

铁虫 (初入文坛)

[求助] 新人,请大侠赐教:构建重组质粒选择双酶切还是单酶切?

初次构建:
已排出了目的基因上已有的酶切位点
也查明多克隆位点上有好几个酶切位点可选择
疑惑该选单酶切还是双酶切??

理论上单酶切不是比双酶切更简单么,为什么我看到网上众多的构建质粒都是采用双酶切,单酶切构建却比较少见到。。
问了实验室师姐 答曰大家都是采用双酶切构建的。。晕
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bleach060452

新虫 (小有名气)

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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-07-18 14:09:19
单酶切,目的片段两侧都得加同一个酶切位点

然后在连接时,质粒自连、目的片段自连、目的片段之间连接、目的片段+载体各种错误连接、目的片段反向连接等等,问题太多;导致后期筛选问题太多,很麻烦。
所以单酶切不是不行

还有没有其他问题,我就不知道了~~

个人理解
岂能尽如人意,但求无愧我心
2楼2013-07-18 12:26:43
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wangweida2

新虫 (小有名气)

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wendell13(gyesang代发): 金币+2, 很对! 2013-07-18 14:09:55
如果构建质粒是用于表达的话建议双酶切。首先可以实现定向克隆。其次连接效率高。选择酶的时候注意不要是同尾酶。用单酶切插入方向不能保证,空载体的比例也会高。如果构建质粒用于阳性对照,TA克隆更方便。
5楼2013-07-18 12:52:20
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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引用回帖:
6楼: Originally posted by wendell13 at 2013-07-18 12:54:09
恩恩 所以实际实验中 双酶切一般优于单酶切使用?...

这个要取决于你是什么实际实验,一般如果你是往一个载体上插入片段的话,需要考虑方向的问题,这时候用双酶切比较好,
单酶切不是不能用,虽然有载体自连的问题,但可以通过载体去磷酸化处理,单酶切连接后,你需要筛选基因的方向,这就比较费事了,多了一个步骤
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
9楼2013-07-18 14:13:41
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roomofxw

木虫 (正式写手)

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wendell13(gyesang代发): 金币+1, 鼓励应助! 2013-07-20 11:49:41
双酶切好处要比單酶切要多,况且现在双酶切也不过是在一管里多加一个酶同时消化,没有比單酶切麻烦什么,那何乐而不为呢
13楼2013-07-19 09:12:51
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huanghznd

金虫 (小有名气)

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gyesang: 金币+2, 很对! 2013-07-18 14:09:36
双酶切是两个不同的酶切位点,连接时基因序列的方向可控,单酶方向不可控,另外,单酶切载体容易发生自连,降低效率。
3楼2013-07-18 12:27:26
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wendell13

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by bleach060452 at 2013-07-18 12:26:43
单酶切,目的片段两侧都得加同一个酶切位点

然后在连接时,质粒自连、目的片段自连、目的片段之间连接、目的片段+载体各种错误连接、目的片段反向连接等等,问题太多;导致后期筛选问题太多,很麻烦。
所以单酶 ...

所以,在双酶切和单酶切的可行的情况下,一般优选双酶切了?
4楼2013-07-18 12:51:38
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wendell13

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by huanghznd at 2013-07-18 12:27:26
双酶切是两个不同的酶切位点,连接时基因序列的方向可控,单酶方向不可控,另外,单酶切载体容易发生自连,降低效率。

恩恩 所以实际实验中 双酶切一般优于单酶切使用?
6楼2013-07-18 12:54:09
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hyphen007

金虫 (小有名气)

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wendell13(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-07-18 14:13:59
双酶切用于定向克隆,貌似啊,单酶切就不行了
7楼2013-07-18 12:56:05
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huanghznd

金虫 (小有名气)

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wendell13(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流! 2013-07-18 14:14:05
引用回帖:
6楼: Originally posted by wendell13 at 2013-07-18 12:54:09
恩恩 所以实际实验中 双酶切一般优于单酶切使用?...

那是当然了,做一般的分子实验用双酶切比较好。
8楼2013-07-18 12:59:22
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zhoupeng87

版主 (文学泰斗)

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看你要切谁以及想得到什么了
10楼2013-07-18 17:29:33
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