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wendell13

铁虫 (初入文坛)

[求助] 新人，请大侠赐教：构建重组质粒选择双酶切还是单酶切？

初次构建：
已排出了目的基因上已有的酶切位点
也查明多克隆位点上有好几个酶切位点可选择
疑惑该选单酶切还是双酶切？？

理论上单酶切不是比双酶切更简单么，为什么我看到网上众多的构建质粒都是采用双酶切，单酶切构建却比较少见到。。
问了实验室师姐 答曰大家都是采用双酶切构建的。。晕
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1楼 2013-07-18 12:04:21
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

bleach060452

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-18 14:09:19
单酶切，目的片段两侧都得加同一个酶切位点

然后在连接时，质粒自连、目的片段自连、目的片段之间连接、目的片段+载体各种错误连接、目的片段反向连接等等，问题太多；导致后期筛选问题太多，很麻烦。
所以单酶切不是不行

还有没有其他问题，我就不知道了~~

个人理解
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岂能尽如人意，但求无愧我心
2楼2013-07-18 12:26:43
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wangweida2

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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wendell13(gyesang代发): 金币+2, 很对！ 2013-07-18 14:09:55
如果构建质粒是用于表达的话建议双酶切。首先可以实现定向克隆。其次连接效率高。选择酶的时候注意不要是同尾酶。用单酶切插入方向不能保证，空载体的比例也会高。如果构建质粒用于阳性对照，TA克隆更方便。
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5楼2013-07-18 12:52:20
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

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引用回帖:
6楼: Originally posted by wendell13 at 2013-07-18 12:54:09
恩恩 所以实际实验中 双酶切一般优于单酶切使用？...

这个要取决于你是什么实际实验，一般如果你是往一个载体上插入片段的话，需要考虑方向的问题，这时候用双酶切比较好，
单酶切不是不能用，虽然有载体自连的问题，但可以通过载体去磷酸化处理，单酶切连接后，你需要筛选基因的方向，这就比较费事了，多了一个步骤
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
9楼2013-07-18 14:13:41
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roomofxw

木虫 (正式写手)

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★
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wendell13(gyesang代发): 金币+1, 鼓励应助！ 2013-07-20 11:49:41
双酶切好处要比單酶切要多，况且现在双酶切也不过是在一管里多加一个酶同时消化，没有比單酶切麻烦什么，那何乐而不为呢
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13楼2013-07-19 09:12:51
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普通回帖

huanghznd

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 很对！ 2013-07-18 14:09:36
双酶切是两个不同的酶切位点，连接时基因序列的方向可控，单酶方向不可控，另外，单酶切载体容易发生自连，降低效率。
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3楼2013-07-18 12:27:26
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wendell13

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bleach060452 at 2013-07-18 12:26:43
单酶切，目的片段两侧都得加同一个酶切位点

然后在连接时，质粒自连、目的片段自连、目的片段之间连接、目的片段+载体各种错误连接、目的片段反向连接等等，问题太多；导致后期筛选问题太多，很麻烦。
所以单酶 ...

所以，在双酶切和单酶切的可行的情况下，一般优选双酶切了？
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4楼2013-07-18 12:51:38
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wendell13

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by huanghznd at 2013-07-18 12:27:26
双酶切是两个不同的酶切位点，连接时基因序列的方向可控，单酶方向不可控，另外，单酶切载体容易发生自连，降低效率。

恩恩 所以实际实验中 双酶切一般优于单酶切使用？
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6楼2013-07-18 12:54:09
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hyphen007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wendell13(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-07-18 14:13:59
双酶切用于定向克隆，貌似啊，单酶切就不行了
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7楼2013-07-18 12:56:05
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huanghznd

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
wendell13(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-07-18 14:14:05
引用回帖:
6楼: Originally posted by wendell13 at 2013-07-18 12:54:09
恩恩 所以实际实验中 双酶切一般优于单酶切使用？...

那是当然了，做一般的分子实验用双酶切比较好。
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8楼2013-07-18 12:59:22
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zhoupeng87

版主 (文学泰斗)

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【答案】应助回帖

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看你要切谁以及想得到什么了
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10楼2013-07-18 17:29:33
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