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wendell13

铁虫 (初入文坛)

[求助] 新人,请大侠赐教:构建重组质粒选择双酶切还是单酶切?

初次构建:
已排出了目的基因上已有的酶切位点
也查明多克隆位点上有好几个酶切位点可选择
疑惑该选单酶切还是双酶切??

理论上单酶切不是比双酶切更简单么,为什么我看到网上众多的构建质粒都是采用双酶切,单酶切构建却比较少见到。。
问了实验室师姐 答曰大家都是采用双酶切构建的。。晕
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huanghznd

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 很对! 2013-07-18 14:09:36
双酶切是两个不同的酶切位点,连接时基因序列的方向可控,单酶方向不可控,另外,单酶切载体容易发生自连,降低效率。
3楼2013-07-18 12:27:26
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bleach060452

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-07-18 14:09:19
单酶切,目的片段两侧都得加同一个酶切位点

然后在连接时,质粒自连、目的片段自连、目的片段之间连接、目的片段+载体各种错误连接、目的片段反向连接等等,问题太多;导致后期筛选问题太多,很麻烦。
所以单酶切不是不行

还有没有其他问题,我就不知道了~~

个人理解
岂能尽如人意,但求无愧我心
2楼2013-07-18 12:26:43
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wendell13

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by bleach060452 at 2013-07-18 12:26:43
单酶切,目的片段两侧都得加同一个酶切位点

然后在连接时,质粒自连、目的片段自连、目的片段之间连接、目的片段+载体各种错误连接、目的片段反向连接等等,问题太多;导致后期筛选问题太多,很麻烦。
所以单酶 ...

所以,在双酶切和单酶切的可行的情况下,一般优选双酶切了?
4楼2013-07-18 12:51:38
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wangweida2

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
wendell13(gyesang代发): 金币+2, 很对! 2013-07-18 14:09:55
如果构建质粒是用于表达的话建议双酶切。首先可以实现定向克隆。其次连接效率高。选择酶的时候注意不要是同尾酶。用单酶切插入方向不能保证,空载体的比例也会高。如果构建质粒用于阳性对照,TA克隆更方便。
5楼2013-07-18 12:52:20
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