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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 新人，请大侠赐教：构建重组质粒选择双酶切还是单酶切？
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wendell13

铁虫 (初入文坛)

[求助] 新人，请大侠赐教：构建重组质粒选择双酶切还是单酶切？

初次构建：
已排出了目的基因上已有的酶切位点
也查明多克隆位点上有好几个酶切位点可选择
疑惑该选单酶切还是双酶切？？

理论上单酶切不是比双酶切更简单么，为什么我看到网上众多的构建质粒都是采用双酶切，单酶切构建却比较少见到。。
问了实验室师姐 答曰大家都是采用双酶切构建的。。晕
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1楼 2013-07-18 12:04:21
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huanghznd

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 很对！ 2013-07-18 14:09:36
双酶切是两个不同的酶切位点，连接时基因序列的方向可控，单酶方向不可控，另外，单酶切载体容易发生自连，降低效率。
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3楼2013-07-18 12:27:26
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bleach060452

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-18 14:09:19
单酶切，目的片段两侧都得加同一个酶切位点

然后在连接时，质粒自连、目的片段自连、目的片段之间连接、目的片段+载体各种错误连接、目的片段反向连接等等，问题太多；导致后期筛选问题太多，很麻烦。
所以单酶切不是不行

还有没有其他问题，我就不知道了~~

个人理解
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岂能尽如人意，但求无愧我心
2楼2013-07-18 12:26:43
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wendell13

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bleach060452 at 2013-07-18 12:26:43
单酶切，目的片段两侧都得加同一个酶切位点

然后在连接时，质粒自连、目的片段自连、目的片段之间连接、目的片段+载体各种错误连接、目的片段反向连接等等，问题太多；导致后期筛选问题太多，很麻烦。
所以单酶 ...

所以，在双酶切和单酶切的可行的情况下，一般优选双酶切了？
赞一下 回复此楼
4楼2013-07-18 12:51:38
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wangweida2

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wendell13(gyesang代发): 金币+2, 很对！ 2013-07-18 14:09:55
如果构建质粒是用于表达的话建议双酶切。首先可以实现定向克隆。其次连接效率高。选择酶的时候注意不要是同尾酶。用单酶切插入方向不能保证，空载体的比例也会高。如果构建质粒用于阳性对照，TA克隆更方便。
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5楼2013-07-18 12:52:20
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