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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 求助！双酶切验证总切出来四条带，请亲们帮忙看看，非常着急啊！谢谢大家了！
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zhangxiwu123

新虫 (正式写手)

[求助] 求助！双酶切验证总切出来四条带，请亲们帮忙看看，非常着急啊！谢谢大家了！ 已有6人参与

本人近期在构建原核表达载体，用的是pET-32a载体，BamHI和Xhol酶切位点（在软件上搜索过了，目的基因不含这两个酶切位点），连接、转化好后，菌液PCR鉴定均未阳性，但是酶切，不论切1h,2h,3h，一直都是四条带，奇怪的很。麻烦大家帮我看看是怎么回事呢？谢谢大家了！
      下面是电泳图，1（目的基因1000bp左右）、3 （目的基因300左右）泳道是重组质粒双酶切的结果，2,4泳道是没被酶切的重组质粒。Marker不小心点错了，点成600的了。

求助！双酶切验证总切出来四条带，请亲们帮忙看看，非常着急啊！谢谢大家了！


求助！双酶切验证总切出来四条带，请亲们帮忙看看，非常着急啊！谢谢大家了！-1
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1楼 2014-08-22 09:13:01
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

WOAIDACHANG

禁言 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhangxiwu123: 金币+15, ★★★★★最佳答案 2014-08-23 10:55:06
本帖内容被屏蔽
11楼2014-08-22 22:06:08
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普通回帖

zhangxiwu123

新虫 (正式写手)
为什么没有人呢？
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2楼2014-08-22 09:28:26
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhangxiwu123: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-08-22 10:57:44
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-08-22 14:40:00
你的质粒，切了和不切的，大小几乎一样的。
而且，你的1应该是目的条带300吧，怎么看都不会是1000啊。
如果自己不能确定载体有没有这两个酶切位点，那你把原始载体切了看看。
最后，重新制备载体，片段，重新做。一定要酶切完全。
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3楼2014-08-22 10:21:34
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zhangxiwu123

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-08-22 10:21:34
你的质粒，切了和不切的，大小几乎一样的。
而且，你的1应该是目的条带300吧，怎么看都不会是1000啊。
如果自己不能确定载体有没有这两个酶切位点，那你把原始载体切了看看。
最后，重新制备载体，片段，重新做。 ...

哦，不好意思，说错了，1是300,3是1000的，原始载体我做过双酶切了，是一条带，载体应该没什么问题。如果用fermentas的酶，酶切一般酶切过长时间呢？
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4楼2014-08-22 10:54:54
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219308

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhangxiwu123: 金币+5, ★有帮助 2014-08-22 16:05:27
你的酶不会是快速的吧？你试试半个小时
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5楼2014-08-22 13:08:26
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
zhangxiwu123: 金币+5 2014-08-22 17:11:03
原始载体我做过双酶切了，是一条带，

双酶切应该有2条带的啊   一条带的话说明有一个酶切位点是不存在的啊。

fermentas的酶我没用过。我用的TAKARA生物。你按说明书的时间切，一般3h，之后取出检测看看切完全没，没有的话继续切。
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6楼2014-08-22 15:32:21
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-23 20:19:16
哦  忘记了   你的片段太小了 ，可能看不出来。你跑胶的时候，跑个10min拿出来看看有没有那条小带。
载体最好单个酶依次切。片段可以双酶切。
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7楼2014-08-22 15:35:02
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zhangxiwu123

新虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 219308 at 2014-08-22 13:08:26
你的酶不会是快速的吧？你试试半个小时

我切了3h，都还不能彻底切开，半个小时应该不行的吧
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8楼2014-08-22 15:43:44
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zhangxiwu123

新虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-08-22 15:35:02
哦  忘记了   你的片段太小了 ，可能看不出来。你跑胶的时候，跑个10min拿出来看看有没有那条小带。
载体最好单个酶依次切。片段可以双酶切。

你的意思是我还得重新开始做是吧？哎，一个周期好长时间啊，
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9楼2014-08-22 15:49:49
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zhangxiwu123

新虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-08-22 15:35:02
哦  忘记了   你的片段太小了 ，可能看不出来。你跑胶的时候，跑个10min拿出来看看有没有那条小带。
载体最好单个酶依次切。片段可以双酶切。

是啊，两个酶切位点之间才40个碱基对。我想问问，如果测序回来，结果正确，是不是就不用做双酶切验证了？
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10楼2014-08-22 15:51:46
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