应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 求助！双酶切验证总切出来四条带，请亲们帮忙看看，非常着急啊！谢谢大家了！
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
331/4返回列表1234下一页
查看: 4274  |  回复: 32
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

zhangxiwu123

新虫 (正式写手)

[求助] 求助！双酶切验证总切出来四条带，请亲们帮忙看看，非常着急啊！谢谢大家了！ 已有6人参与

本人近期在构建原核表达载体，用的是pET-32a载体，BamHI和Xhol酶切位点（在软件上搜索过了，目的基因不含这两个酶切位点），连接、转化好后，菌液PCR鉴定均未阳性，但是酶切，不论切1h,2h,3h，一直都是四条带，奇怪的很。麻烦大家帮我看看是怎么回事呢？谢谢大家了！
      下面是电泳图，1（目的基因1000bp左右）、3 （目的基因300左右）泳道是重组质粒双酶切的结果，2,4泳道是没被酶切的重组质粒。Marker不小心点错了，点成600的了。

求助！双酶切验证总切出来四条带，请亲们帮忙看看，非常着急啊！谢谢大家了！


求助！双酶切验证总切出来四条带，请亲们帮忙看看，非常着急啊！谢谢大家了！-1
93585E02CF1B31AAB0EC2CAA368D37C8.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2014-08-22 09:13:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

WOAIDACHANG

禁言 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhangxiwu123: 金币+15, ★★★★★最佳答案 2014-08-23 10:55:06
本帖内容被屏蔽
11楼2014-08-22 22:06:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

zhangxiwu123

新虫 (正式写手)
为什么没有人呢？
赞一下 回复此楼
2楼2014-08-22 09:28:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhangxiwu123: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-08-22 10:57:44
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-08-22 14:40:00
你的质粒，切了和不切的，大小几乎一样的。
而且，你的1应该是目的条带300吧，怎么看都不会是1000啊。
如果自己不能确定载体有没有这两个酶切位点，那你把原始载体切了看看。
最后，重新制备载体，片段，重新做。一定要酶切完全。
赞一下 回复此楼
3楼2014-08-22 10:21:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangxiwu123

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-08-22 10:21:34
你的质粒，切了和不切的，大小几乎一样的。
而且，你的1应该是目的条带300吧，怎么看都不会是1000啊。
如果自己不能确定载体有没有这两个酶切位点，那你把原始载体切了看看。
最后，重新制备载体，片段，重新做。 ...

哦，不好意思，说错了，1是300,3是1000的，原始载体我做过双酶切了，是一条带，载体应该没什么问题。如果用fermentas的酶，酶切一般酶切过长时间呢？
赞一下 回复此楼
4楼2014-08-22 10:54:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

219308

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhangxiwu123: 金币+5, ★有帮助 2014-08-22 16:05:27
你的酶不会是快速的吧？你试试半个小时
赞一下 回复此楼
5楼2014-08-22 13:08:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
zhangxiwu123: 金币+5 2014-08-22 17:11:03
原始载体我做过双酶切了，是一条带，

双酶切应该有2条带的啊   一条带的话说明有一个酶切位点是不存在的啊。

fermentas的酶我没用过。我用的TAKARA生物。你按说明书的时间切，一般3h，之后取出检测看看切完全没，没有的话继续切。
赞一下 回复此楼
6楼2014-08-22 15:32:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-23 20:19:16
哦  忘记了   你的片段太小了 ，可能看不出来。你跑胶的时候，跑个10min拿出来看看有没有那条小带。
载体最好单个酶依次切。片段可以双酶切。
赞一下 回复此楼
7楼2014-08-22 15:35:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangxiwu123

新虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 219308 at 2014-08-22 13:08:26
你的酶不会是快速的吧？你试试半个小时

我切了3h，都还不能彻底切开，半个小时应该不行的吧
赞一下 回复此楼
8楼2014-08-22 15:43:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangxiwu123

新虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-08-22 15:35:02
哦  忘记了   你的片段太小了 ，可能看不出来。你跑胶的时候，跑个10min拿出来看看有没有那条小带。
载体最好单个酶依次切。片段可以双酶切。

你的意思是我还得重新开始做是吧？哎，一个周期好长时间啊，
赞一下 回复此楼
9楼2014-08-22 15:49:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangxiwu123

新虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-08-22 15:35:02
哦  忘记了   你的片段太小了 ，可能看不出来。你跑胶的时候，跑个10min拿出来看看有没有那条小带。
载体最好单个酶依次切。片段可以双酶切。

是啊，两个酶切位点之间才40个碱基对。我想问问，如果测序回来，结果正确，是不是就不用做双酶切验证了？
赞一下 回复此楼
10楼2014-08-22 15:51:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 zhangxiwu123 的主题更新
331/4返回列表1234下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 调剂310 +6 温柔的晚安 2026-03-25 7/350 2026-03-28 16:04 by qq2000
[考研] 265求调剂11408 +3 刘小鹿lu 2026-03-27 3/150 2026-03-27 20:53 by nihaoar
[考研] 085600材料与化工调剂 +10 A-哆啦Z梦 2026-03-23 16/800 2026-03-27 15:13 by caszguilin
[考研] 303求调剂 +7 安忆灵 2026-03-22 8/400 2026-03-27 11:46 by sanrepian
[考研] 304材料求调剂 +4 钟llll 2026-03-26 4/200 2026-03-27 03:42 by wxiongid
[考研] 336材料求调剂 +7 陈滢莹 2026-03-26 9/450 2026-03-27 00:20 by wxiongid
[考研] 调剂 +4 柚柚yoyo 2026-03-26 4/200 2026-03-26 20:43 by fmesaito
[考研] 材料与化工304求B区调剂 +3 邱gl 2026-03-26 6/300 2026-03-26 18:03 by 邱gl
[考研] 271求调剂 +6 生如夏花… 2026-03-22 6/300 2026-03-26 16:48 by 张凯十八号
[考研] 一志愿上海交大生物与医药专硕324分，求调剂 +6 jiajunX 2026-03-22 6/300 2026-03-25 23:05 by licg0208
[考研] 机械学硕总分317求调剂！！！！ +4 Acaciad 2026-03-25 4/200 2026-03-25 19:59 by hanserlol
[考研] 网络空间安全0839招调剂 +4 w320357296 2026-03-25 6/300 2026-03-25 17:59 by 255671
[考研] 0854电子信息求调剂 +7 α____ 2026-03-22 9/450 2026-03-25 13:37 by α____
[考研] 284求调剂 +15 Zhao anqi 2026-03-22 15/750 2026-03-25 12:51 by wht0531
[考研] 材料调剂 +3 iwinso 2026-03-23 3/150 2026-03-25 11:29 by greychen00
[考研] 318求调剂 +3 plum李子 2026-03-23 3/150 2026-03-25 09:42 by 雾散后相遇lc
[考研] 340求调剂 +5 话梅糖111 2026-03-24 5/250 2026-03-25 06:53 by ilovexiaobin
[考研] 300求调剂，材料科学英一数二 +5 leaflight 2026-03-24 5/250 2026-03-24 16:25 by laoshidan
[考研] 接收2026硕士调剂(学硕+专硕) +4 allen-yin 2026-03-23 6/300 2026-03-23 15:04 by 汪！？！
[考研] 求老师收我 +3 zzh16938784 2026-03-23 3/150 2026-03-23 12:56 by ztnimte
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭