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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 求助！双酶切验证总切出来四条带，请亲们帮忙看看，非常着急啊！谢谢大家了！
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhangxiwu123: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-08-24 18:36:21
1.可能质粒上有多个酶切位点，你在切空载体的时候因为被酶切的片段太小所以看不出来。
2.可能酶切体系甘油过多造成星效应。
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21楼2014-08-24 10:09:32
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sunshine436

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhangxiwu123: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-08-24 18:36:08
fermentas的快切酶，如果只是鉴定的话，10分钟就可以跑电泳了，如果要回收的，切2h 足够，1ul的酶切2ug 的质粒是没问题的，你这个情况说不准是哪的问题，只能全部重新做了，一周时间也还好，挺快的。

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22楼2014-08-24 11:15:53
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WOAIDACHANG

禁言 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
23楼2014-08-24 13:14:17
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zhangxiwu123

新虫 (正式写手)
引用回帖:
21楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-08-24 10:09:32
1.可能质粒上有多个酶切位点，你在切空载体的时候因为被酶切的片段太小所以看不出来。
2.可能酶切体系甘油过多造成星效应。

嗯，第一种真是有可能，第二种，你的意思是，buffer里面所含的甘油多引起星效应吗？星效应具体是什么意思呢？
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24楼2014-08-24 18:25:57
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zhangxiwu123

新虫 (正式写手)
引用回帖:
22楼: Originally posted by sunshine436 at 2014-08-24 11:15:53
fermentas的快切酶，如果只是鉴定的话，10分钟就可以跑电泳了，如果要回收的，切2h 足够，1ul的酶切2ug 的质粒是没问题的，你这个情况说不准是哪的问题，只能全部重新做了，一周时间也还好，挺快的。
...

我用的好像不是快切酶，切了16个小时，还是有切不开的。
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25楼2014-08-24 18:26:44
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zhangxiwu123

新虫 (正式写手)
引用回帖:
23楼: Originally posted by WOAIDACHANG at 2014-08-24 13:14:17
做出来，记得告诉我，加油...

好的，非常感谢。我觉得还有一种可能，是连接的时候，很多载体自连了，也有与目的基因连住了，所以会出现那种情况。
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26楼2014-08-24 18:28:13
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linhehu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
载体里面有酶切位点。直接测序比对吧。方便省事

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在知识的海洋里裸泳
27楼2014-08-24 18:48:02
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
24楼: Originally posted by zhangxiwu123 at 2014-08-24 18:25:57
嗯，第一种真是有可能，第二种，你的意思是，buffer里面所含的甘油多引起星效应吗？星效应具体是什么意思呢？...

甘油浓度超过5%的时候，内切酶的特异性变差，能酶切序列相似的位点。
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28楼2014-08-24 19:53:32
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sunshine436

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
25楼: Originally posted by zhangxiwu123 at 2014-08-24 18:26:44
我用的好像不是快切酶，切了16个小时，还是有切不开的。...

你测一下浓度，可以少切点，做连接的话，载体有一点就行。

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29楼2014-08-24 21:26:20
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sunshine436

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
24楼: Originally posted by zhangxiwu123 at 2014-08-24 18:25:57
嗯，第一种真是有可能，第二种，你的意思是，buffer里面所含的甘油多引起星效应吗？星效应具体是什么意思呢？...

有星号活性的酶，不能切太长时间，一般2个小时，时间再长会乱切，BamHI好像是有星号活性。

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30楼2014-08-24 21:29:56
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