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zhangxiwu123

新虫 (正式写手)

[求助] 求助！双酶切验证总切出来四条带，请亲们帮忙看看，非常着急啊！谢谢大家了！ 已有6人参与

本人近期在构建原核表达载体，用的是pET-32a载体，BamHI和Xhol酶切位点（在软件上搜索过了，目的基因不含这两个酶切位点），连接、转化好后，菌液PCR鉴定均未阳性，但是酶切，不论切1h,2h,3h，一直都是四条带，奇怪的很。麻烦大家帮我看看是怎么回事呢？谢谢大家了！
      下面是电泳图，1（目的基因1000bp左右）、3 （目的基因300左右）泳道是重组质粒双酶切的结果，2,4泳道是没被酶切的重组质粒。Marker不小心点错了，点成600的了。

求助！双酶切验证总切出来四条带，请亲们帮忙看看，非常着急啊！谢谢大家了！


求助！双酶切验证总切出来四条带，请亲们帮忙看看，非常着急啊！谢谢大家了！-1
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1楼 2014-08-22 09:13:01
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
24楼: Originally posted by zhangxiwu123 at 2014-08-24 18:25:57
嗯，第一种真是有可能，第二种，你的意思是，buffer里面所含的甘油多引起星效应吗？星效应具体是什么意思呢？...

甘油浓度超过5%的时候，内切酶的特异性变差，能酶切序列相似的位点。
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28楼2014-08-24 19:53:32
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查看全部 33 个回答

zhangxiwu123

新虫 (正式写手)
为什么没有人呢？
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2楼2014-08-22 09:28:26
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhangxiwu123: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-08-22 10:57:44
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-08-22 14:40:00
你的质粒，切了和不切的，大小几乎一样的。
而且，你的1应该是目的条带300吧，怎么看都不会是1000啊。
如果自己不能确定载体有没有这两个酶切位点，那你把原始载体切了看看。
最后，重新制备载体，片段，重新做。一定要酶切完全。
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3楼2014-08-22 10:21:34
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zhangxiwu123

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-08-22 10:21:34
你的质粒，切了和不切的，大小几乎一样的。
而且，你的1应该是目的条带300吧，怎么看都不会是1000啊。
如果自己不能确定载体有没有这两个酶切位点，那你把原始载体切了看看。
最后，重新制备载体，片段，重新做。 ...

哦，不好意思，说错了，1是300,3是1000的，原始载体我做过双酶切了，是一条带，载体应该没什么问题。如果用fermentas的酶，酶切一般酶切过长时间呢？
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4楼2014-08-22 10:54:54
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