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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 求助！双酶切验证总切出来四条带，请亲们帮忙看看，非常着急啊！谢谢大家了！
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WOAIDACHANG

禁言 (正式写手)
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感谢参与，应助指数 +1
zhangxiwu123: 金币+15, ★★★★★最佳答案 2014-08-23 10:55:06
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11楼2014-08-22 22:06:08
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WOAIDACHANG

禁言 (正式写手)
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zhangxiwu123(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-08-23 20:19:37
zhangxiwu123: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-08-23 22:37:18
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12楼2014-08-22 22:15:03
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zhangxiwu123

新虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by WOAIDACHANG at 2014-08-22 22:06:08
可能的原因，第一，我之前出现过，酶切之后有四条条带，原因是原始质粒出现了污染，将原始质粒酶切之后会出现三条带。你这原始pET-32a载体没有问题。应该不是pET-32a载体的问题。第二，你做一个PCR鉴定，看能不能扩 ...

谢谢你很认真的回答。pET-32a载体没问题，PCR鉴定是阳性，提重组质粒应该没什么问题，之前目的基因酶切后跑胶是一条带，我才回收的。
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13楼2014-08-23 10:11:24
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zhangxiwu123

新虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by WOAIDACHANG at 2014-08-22 22:15:03
你能够切出来目的条带，应该是连上了，而且目的片段都是合适的大小。原因只有一个，那就是出现在载体身上。你的情况，应该和我上次遇到的是一样的。你重新提pET-32a载体，重做。即便测序正确，也不要使用，这种莫名 ...

嗯，昨天用又做了个酶切，16h，还是那个样子，看来只好是重新做了。请问，你用的是fermentas的酶吗？50ul体系加40ul的浓度为60ng/uL的质粒不多吗？是剩余的5uL全加成buffer吗？
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14楼2014-08-23 10:16:38
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WOAIDACHANG

禁言 (正式写手)
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15楼2014-08-23 19:02:11
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WOAIDACHANG

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16楼2014-08-23 19:06:06
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by zhangxiwu123 at 2014-08-22 15:51:46
是啊，两个酶切位点之间才40个碱基对。我想问问，如果测序回来，结果正确，是不是就不用做双酶切验证了？...

测序都对了，就不用验证了。
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17楼2014-08-23 19:55:46
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by zhangxiwu123 at 2014-08-22 15:49:49
你的意思是我还得重新开始做是吧？哎，一个周期好长时间啊，...

如果结果不好，最好重做，不要着急，慢慢做，做稳当。
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18楼2014-08-23 19:56:34
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zhangxiwu123

新虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by WOAIDACHANG at 2014-08-23 19:06:06
你重新做的话，全部换新的，最重要的是保证你的pET-32a载体自身是没有问题的，你重新提pET-32a，加油，一定可以找到原因。...

好的，谢谢你，希望下一次顺利！也祝你顺利！
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19楼2014-08-23 22:36:23
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zhangxiwu123

新虫 (正式写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-08-23 19:56:34
如果结果不好，最好重做，不要着急，慢慢做，做稳当。...

嗯，谢谢鼓励，也祝你一切顺利。
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20楼2014-08-23 22:36:52
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