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zhangxiwu123

新虫 (正式写手)

[求助] 求助!双酶切验证总切出来四条带,请亲们帮忙看看,非常着急啊!谢谢大家了! 已有6人参与

本人近期在构建原核表达载体,用的是pET-32a载体,BamHI和Xhol酶切位点(在软件上搜索过了,目的基因不含这两个酶切位点),连接、转化好后,菌液PCR鉴定均未阳性,但是酶切,不论切1h,2h,3h,一直都是四条带,奇怪的很。麻烦大家帮我看看是怎么回事呢?谢谢大家了!
      下面是电泳图,1(目的基因1000bp左右)、3 (目的基因300左右)泳道是重组质粒双酶切的结果,2,4泳道是没被酶切的重组质粒。Marker不小心点错了,点成600的了。

求助!双酶切验证总切出来四条带,请亲们帮忙看看,非常着急啊!谢谢大家了!


求助!双酶切验证总切出来四条带,请亲们帮忙看看,非常着急啊!谢谢大家了!-1
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zhangxiwu123

新虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-08-22 15:35:02
哦  忘记了   你的片段太小了 ,可能看不出来。你跑胶的时候,跑个10min拿出来看看有没有那条小带。
载体最好单个酶依次切。片段可以双酶切。

是啊,两个酶切位点之间才40个碱基对。我想问问,如果测序回来,结果正确,是不是就不用做双酶切验证了?
10楼2014-08-22 15:51:46
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zhangxiwu123

新虫 (正式写手)

为什么没有人呢?
2楼2014-08-22 09:28:26
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
zhangxiwu123: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-08-22 10:57:44
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-08-22 14:40:00
你的质粒,切了和不切的,大小几乎一样的。
而且,你的1应该是目的条带300吧,怎么看都不会是1000啊。
如果自己不能确定载体有没有这两个酶切位点,那你把原始载体切了看看。
最后,重新制备载体,片段,重新做。一定要酶切完全。
3楼2014-08-22 10:21:34
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zhangxiwu123

新虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-08-22 10:21:34
你的质粒,切了和不切的,大小几乎一样的。
而且,你的1应该是目的条带300吧,怎么看都不会是1000啊。
如果自己不能确定载体有没有这两个酶切位点,那你把原始载体切了看看。
最后,重新制备载体,片段,重新做。 ...

哦,不好意思,说错了,1是300,3是1000的,原始载体我做过双酶切了,是一条带,载体应该没什么问题。如果用fermentas的酶,酶切一般酶切过长时间呢?
4楼2014-08-22 10:54:54
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