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小木可

铁虫 (初入文坛)

[求助] 单酶切跟双酶切电泳条带一样，且都比空质粒跑的快，什么原因？ 已有4人参与

用PBI121质粒进行SmaI和XbaI双酶切，跑电泳回收时，发现酶切片段跑的比空质粒快。然后我又分别用两种酶做单酶切，跑电泳，发现单酶切和双酶切跑的位置一样，而且都比空质粒跑的快，这是什么原因呢？我上大二，目前真心搞不明白，求大神指导。图中从左到右依次是：marker   空质粒   SmaI   XbaI   SmaI+XbaI

单酶切跟双酶切电泳条带一样，且都比空质粒跑的快，什么原因？
2014.10.5.HZK1..jpg
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1楼 2014-10-05 22:43:18
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 鼓励发帖积极交流。 2014-10-06 12:35:25
小木可: 金币+1 2014-10-06 17:20:33
酶切后的质粒比环状质粒快，2个酶切位点太接近时，双酶切和单酶切看不出差别。
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2楼2014-10-06 09:28:57
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青师大涛声

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-10-06 12:35:39
空质粒的片段大于酶切片段，所以要慢些。
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好好做实验。
3楼2014-10-06 10:06:58
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就会提核酸

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-10-06 12:35:53
小木可: 金币+1 2014-10-06 17:21:33
质粒分三型：闭环，开环，线性。大部分情况下，的确都是闭环跑得比线性快。但是，下列几个因素的结合，可以导致闭环比线性跑得慢：高浓度胶，高电压，胶中 EB 浓度正好合适。更多知识，可参考卢圣栋主编的“现代分子生物学实验技术”。
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4楼2014-10-06 10:59:31
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小木可

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-10-06 09:28:57
酶切后的质粒比环状质粒快，2个酶切位点太接近时，双酶切和单酶切看不出差别。

是啊，单酶切跟双酶切看不出差别，可是酶切后的质粒成片段，比空质粒跑的还快，好神奇的感觉，后面的连接啥都不敢做了。
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5楼2014-10-06 11:53:03
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a1353601094

新虫 (初入文坛)
为什么SmaI切的是2条带   SmaI与XbaI双切的只有1条带。。。
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6楼2014-10-06 16:44:32
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小木可

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by a1353601094 at 2014-10-06 16:44:32
为什么SmaI切的是2条带   SmaI与XbaI双切的只有1条带。。。

这个我当时也看到了，老师说是星号活性，我觉得根本就没什么关系，现在又重新按照要求，改进了体系，跑电泳看看。
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7楼2014-10-06 17:19:43
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永远一片天

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

环状质粒由于特殊的共价闭合结构，不能按照一般的线性DNA观察电泳，环状闭合质粒比一般线性DNA跑的慢，线性质粒跑的快，提取质粒时纯化的好的话会出现两条带，有时会出现三条带，均属于正常情况。酶切后，质粒被打开，变成线性双链DNA，自然会跑的较快，之所以你的单酶切和双酶切条带大小一样，是因为你的两个酶切位点相近，都处在质粒集中酶切位点的那段序列上，单酶会产生一个线性条带，双酶切切开后会产生两个条带，一个大条带，一个小条带，大条带跟单酶切大小相似，所以难以分清高低，双酶切产生的小条带实在太小，基本看不到。
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8楼2014-10-19 10:32:54
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