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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 同尾酶连接效率问题，求助
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small521

银虫 (小有名气)

[交流] 同尾酶连接效率问题，求助

我有一个已经连接上载体的大片段，为xhoI连接，我的目的载体上面没有xhoI这个位点，但是有SalI，我打算利用这个同尾酶进行连接，不过因为载体自连，至今也没有筛到阳性，不知有没有做过同尾酶连接的大师帮我看看，我这么做有没有问题，还想问问这样的同尾酶连接有没有连上的可能，效率高不高？

还有，我是大片段连接，片段约12k，载体5k，连接起来比较费劲，不过前人已经有连接的成功案例，只是人家是双酶切，和我这有些不同，还有没有做过的高人指点一二，谢了
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1楼2013-11-05 14:04:35
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small521

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gaohuihui at 2013-11-05 16:00:41
XhoI  SalI同尾酶很好连接的， 载体自连是你载体去磷效果不好啊

我没有去磷酸化，因为我师兄说去了效果也不好，自连也会很多，而且会影响非自连的效率，那如果连接效率高的话那我就放心筛了，谢谢了
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3楼2013-11-05 16:05:10
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gaohuihui

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
small521: 金币+1 2013-11-05 16:05:33
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-05 18:15:30
XhoI  SalI同尾酶很好连接的， 载体自连是你载体去磷效果不好啊
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2楼2013-11-05 16:00:41
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-06 10:24:24
small521: 金币+1 2013-11-07 13:13:18
去磷酸化后一般载体的自连可以降低到接近0。双酶切可以不用，单酶切的话一般是要取磷酸化的，否则自连的概率太高了。
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4楼2013-11-06 07:55:44
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