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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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新虫 (初入文坛)

[求助] pEGFP重组载体转染细胞不发光,空载体发光,这是啥原因啊,急 已有1人参与

如题,空质粒转染细胞后4小时就能看到部分细胞荧光,但是重组质粒一点都没有,转然后八小时在看还是这样。请教大家这是什么原因呢?我用的是N1,目的片段长度两千多。还有一个多月就该走了,没想到又遇到这个问题,求救啊,各位
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-30 13:38:13
重组之力移码突变的可能性很大,建议自己好好比对一下,移码突变之后GFP肯定不发光,另外观察荧光都是24H后,如果确定质粒没问题,就24小时后再看,你也太着急了吧。
4楼2012-07-29 18:56:09
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普通回帖

somer2012

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励发帖帮助解答问题。 2012-07-29 18:18:12
建议你耐心等一等,好歹给人家24小时以完成从DNA到蛋白质的过程。
等待的同时可以考虑:1、转染效率问题
                    2、目的蛋白的稳定性问题(容易降解的蛋白要把蛋白"半衰期"(half life)考察一下)
                    3、质粒构建问题(测序结果是否认真比对了等)
但愿有帮助。
2楼2012-07-29 12:31:24
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fjtony163

版主 (文坛精英)

米米

优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-29 20:51:38
你确认电转染成功没有,GFP的荧光效果不错应该不会有问题,

你大概有多少colony。
3楼2012-07-29 15:20:57
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churchill87426

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
1、至少表达24hr吧,一般48-72
2、读码框移位了?
5楼2012-07-29 21:49:25
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www.712100

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by somer2012 at 2012-07-29 12:31:24
建议你耐心等一等,好歹给人家24小时以完成从DNA到蛋白质的过程。
等待的同时可以考虑:1、转染效率问题
                    2、目的蛋白的稳定性问题(容易降解的蛋白要把蛋白"半衰期"(half life)考 ...

质粒是公司合成的,我也测序看了,只有一个点突变,其余都正确。我现在转染48小时后,12孔板细胞中能有10个左右带微弱荧光的细胞,但是大部分是变圆脱落的死细胞。很难挑单克隆,是不是转染效率的问题啊?不知道有什么办法能提高转染效率么?这次真是毕其功于一役了,╮(╯▽╰)╭
6楼2012-08-02 23:05:53
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新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by fjtony163 at 2012-07-29 15:20:57
你确认电转染成功没有,GFP的荧光效果不错应该不会有问题,

你大概有多少colony。

我现在转染48小时后,12孔板细胞中能有10个左右带微弱荧光的细胞,但是大部分是变圆脱落的死细胞,很难挑单克隆。我初步考虑是转染效率太低了,不知道有什么办法能提高转染效率么?
7楼2012-08-02 23:07:57
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引用回帖:
4楼: Originally posted by huguangdong at 2012-07-29 18:56:09
重组之力移码突变的可能性很大,建议自己好好比对一下,移码突变之后GFP肯定不发光,另外观察荧光都是24H后,如果确定质粒没问题,就24小时后再看,你也太着急了吧。

质粒是公司合成的,我也测序看了,只有一个点突变,其余都正确。我现在转染48小时后,12孔板细胞中能有10个左右带微弱荧光的细胞,但是大部分是变圆脱落的死细胞。很难挑单克隆,是不是转染效率的问题啊?不知道有什么办法能提高转染效率么?
8楼2012-08-02 23:11:57
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引用回帖:
2楼: Originally posted by somer2012 at 2012-07-29 12:31:24
建议你耐心等一等,好歹给人家24小时以完成从DNA到蛋白质的过程。
等待的同时可以考虑:1、转染效率问题
                    2、目的蛋白的稳定性问题(容易降解的蛋白要把蛋白"半衰期"(half life)考 ...

有没有荧光是不是应该看GFP蛋白的半衰期啊?这样的话空载体能看到荧光应该就没有问题吧?
9楼2012-08-02 23:13:24
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引用回帖:
5楼: Originally posted by churchill87426 at 2012-07-29 21:49:25
1、至少表达24hr吧,一般48-72
2、读码框移位了?

现在发现还是有极少数的带荧光的细胞,但是大部分是死细胞,⊙﹏⊙b汗,很难挑克隆。
10楼2012-08-02 23:14:21
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