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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pEGFP重组载体转染细胞不发光，空载体发光，这是啥原因啊，急
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www.712100

新虫 (初入文坛)

[求助] pEGFP重组载体转染细胞不发光，空载体发光，这是啥原因啊，急 已有1人参与

如题，空质粒转染细胞后4小时就能看到部分细胞荧光，但是重组质粒一点都没有，转然后八小时在看还是这样。请教大家这是什么原因呢？我用的是N1，目的片段长度两千多。还有一个多月就该走了，没想到又遇到这个问题，求救啊，各位
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1楼 2012-07-29 11:45:23
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-30 13:38:13
重组之力移码突变的可能性很大，建议自己好好比对一下，移码突变之后GFP肯定不发光，另外观察荧光都是24H后，如果确定质粒没问题，就24小时后再看，你也太着急了吧。
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4楼2012-07-29 18:56:09
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somer2012

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励发帖帮助解答问题。 2012-07-29 18:18:12
建议你耐心等一等，好歹给人家24小时以完成从DNA到蛋白质的过程。
等待的同时可以考虑：1、转染效率问题
                    2、目的蛋白的稳定性问题（容易降解的蛋白要把蛋白"半衰期"（half life）考察一下）
                    3、质粒构建问题（测序结果是否认真比对了等）
但愿有帮助。
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2楼2012-07-29 12:31:24
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fjtony163

版主 (文坛精英)

米米

优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-29 20:51:38
你确认电转染成功没有，GFP的荧光效果不错应该不会有问题，

你大概有多少colony。
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3楼2012-07-29 15:20:57
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churchill87426

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1、至少表达24hr吧，一般48-72
2、读码框移位了？
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5楼2012-07-29 21:49:25
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www.712100

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by somer2012 at 2012-07-29 12:31:24
建议你耐心等一等，好歹给人家24小时以完成从DNA到蛋白质的过程。
等待的同时可以考虑：1、转染效率问题
                    2、目的蛋白的稳定性问题（容易降解的蛋白要把蛋白"半衰期"（half life）考 ...

质粒是公司合成的，我也测序看了，只有一个点突变，其余都正确。我现在转染48小时后，12孔板细胞中能有10个左右带微弱荧光的细胞，但是大部分是变圆脱落的死细胞。很难挑单克隆，是不是转染效率的问题啊？不知道有什么办法能提高转染效率么？这次真是毕其功于一役了，╮(╯▽╰)╭
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6楼2012-08-02 23:05:53
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新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by fjtony163 at 2012-07-29 15:20:57
你确认电转染成功没有，GFP的荧光效果不错应该不会有问题，

你大概有多少colony。

我现在转染48小时后，12孔板细胞中能有10个左右带微弱荧光的细胞，但是大部分是变圆脱落的死细胞，很难挑单克隆。我初步考虑是转染效率太低了，不知道有什么办法能提高转染效率么？
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7楼2012-08-02 23:07:57
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4楼: Originally posted by huguangdong at 2012-07-29 18:56:09
重组之力移码突变的可能性很大，建议自己好好比对一下，移码突变之后GFP肯定不发光，另外观察荧光都是24H后，如果确定质粒没问题，就24小时后再看，你也太着急了吧。

质粒是公司合成的，我也测序看了，只有一个点突变，其余都正确。我现在转染48小时后，12孔板细胞中能有10个左右带微弱荧光的细胞，但是大部分是变圆脱落的死细胞。很难挑单克隆，是不是转染效率的问题啊？不知道有什么办法能提高转染效率么？
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8楼2012-08-02 23:11:57
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2楼: Originally posted by somer2012 at 2012-07-29 12:31:24
建议你耐心等一等，好歹给人家24小时以完成从DNA到蛋白质的过程。
等待的同时可以考虑：1、转染效率问题
                    2、目的蛋白的稳定性问题（容易降解的蛋白要把蛋白"半衰期"（half life）考 ...

有没有荧光是不是应该看GFP蛋白的半衰期啊？这样的话空载体能看到荧光应该就没有问题吧？
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9楼2012-08-02 23:13:24
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引用回帖:
5楼: Originally posted by churchill87426 at 2012-07-29 21:49:25
1、至少表达24hr吧，一般48-72
2、读码框移位了？

现在发现还是有极少数的带荧光的细胞，但是大部分是死细胞，⊙﹏⊙b汗，很难挑克隆。
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10楼2012-08-02 23:14:21
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