| 查看: 1719 | 回复: 6 | ||
[求助]
请问哪位可以帮帮我，看看问题出在哪里？
|
|
最近我在用pcDNA3.1-EGFP载体与一个1.8k左右的片段连接，但连接了一个月了，还是没有连上，想请教一下大家问题出在哪里？ 首先，我讲一下我的实验流程： 1、设计引物扩增出该基因引物， 2、提取RNA，反转录成cDNA，PCR扩增目的片段 3、将目的片段胶回收后连入T载体，检验正确后测序 4、测序正确后，用EcoR I和Hind III 双酶切连接了目的条带的T载体，同时也双酶切了pcDNA3.1-EGFP载体， 5、胶回收了酶切后的1.8k片段和pcDNA3.1-EGFP切开后的片段 6、T4连接酶过夜连接 7、转化、涂板后挑单克隆 8、菌落pcr鉴定，质粒提取鉴定 9、测序鉴定 接下来，我讲一下遇到的问题，在第8步的验证都非常正确，而测序的时候却总是不对，测序的结果显示是一堆大肠杆菌的基因组，我不知道问题出在什么地方，请各位高手指导一下。上传一下第八步的验证图供参考。另外，为什么pcDNA3.1-EGFP与目的片段连接效率怎么这么低呢？我挑了124个单克隆，只出来一个。  L12酶切和质粒酶切.jpg  PC3.1、L12酶切图.jpg  菌落PCR.jpg |
回复此楼» 猜你喜欢
职称评审没过，求安慰
已经有49人回复
-
26申博自荐
已经有3人回复
-
A期刊撤稿
已经有4人回复
-
垃圾破二本职称评审标准
已经有17人回复
-
投稿Elsevier的Neoplasia杂志，到最后选publishing options时页面空白，不能完成投稿
已经有22人回复
-
EST投稿状态问题
已经有7人回复
-
毕业后当辅导员了，天天各种学生超烦
已经有4人回复
-
三无产品还有机会吗
已经有6人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 请教一个有关CV曲线的问题，希望师兄师姐们能进来看看，帮帮我，谢谢大家
已经有5人回复
- 哪位大侠帮我看看，ansys求解时自动退出
已经有6人回复
- 大家来帮帮忙看看我的一堆问题
已经有5人回复
- 求教！哪位大神帮我看看狄拉克方程里的一个问题啊！！
已经有11人回复
- 大家来帮帮我，看看怎么处理呀
已经有21人回复
- 大家爱帮我看看这段MATLAB程序为啥出错了
已经有5人回复
- 英文文章里图片的分辨率问题，很急啊，大家帮帮我吧！
已经有5人回复
- 一个gjf文件，总是pending,各位帮我看看是什么问题？
已经有16人回复
- PCR好多次了，一直没结果，麻烦各位帮我看看是哪出问题了？
已经有15人回复
- 使用diamond软件出现的一个小问题，知道得哥哥姐姐们帮帮忙看看哈
已经有12人回复
- 大家帮我看一个fortran的程序，我总是计算不出正确的结果
已经有20人回复
- 麻烦塔菲尔曲线高手帮我看看这几个图，说明什么问题，或者能从中得出什么信息？
已经有12人回复
- 刚刚和老外视频，简直就是运气啊，大家来帮我看看我的offer模板有什么问题么？
已经有10人回复
- 帮帮忙看看我的难题
已经有15人回复
- 【问题求助】说说我的心里状态，大家帮我看看是不是该去看心理医生了？
已经有28人回复
- 大家帮我看看这个图是怎么画出来的
已经有12人回复
- 【求助】水热法制备磷酸铁锂，大家帮我看看 问题出在哪
已经有35人回复
- 【求助】牛人们，帮帮我，回答几道小问题！！！请快点！！
已经有5人回复
- 求助 SPSS保存的问题，哪位师傅帮帮忙
已经有1人回复
2楼2013-06-12 23:32:43
3楼2013-06-13 07:52:20
4楼2013-06-13 08:43:17
5楼2013-07-03 16:14:34
zhouking8758
木虫 (正式写手)
- 应助: 18 (小学生)
- 金币: 2418.5
- 散金: 27
- 红花: 2
- 帖子: 369
- 在线: 289.9小时
- 虫号: 691834
- 注册: 2009-01-12
- 专业: 生物大分子结构与功能
6楼2013-07-03 16:37:01
【答案】应助回帖
★
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-04 08:49:53
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-04 08:49:53
|
一百多个得到一个，效率太低了，而且可能转到细胞内表达都是问题。如果是我的话，我会选择从头开始，如果时间安排紧凑三五天就可以完成。 很明显你的L12没有任何问题， pcDNA3.1-EGFP质粒最好重新转化一下，得到新制备的质粒进行酶切。可以选择一个引物测一下质粒，保证没有任何问题。 菌落pcr有时得到很多的假阳性，有时未连接的产物混到了菌落的周围，得到了错误的信号。 下次如果要做的话，PCR鉴定对的，提取质粒做个酶切，检测一下你的插入片段能不能被切下来 祝好运 |
7楼2013-07-04 00:48:40