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[求助]
请问哪位可以帮帮我，看看问题出在哪里？
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最近我在用pcDNA3.1-EGFP载体与一个1.8k左右的片段连接，但连接了一个月了，还是没有连上，想请教一下大家问题出在哪里？ 首先，我讲一下我的实验流程： 1、设计引物扩增出该基因引物， 2、提取RNA，反转录成cDNA，PCR扩增目的片段 3、将目的片段胶回收后连入T载体，检验正确后测序 4、测序正确后，用EcoR I和Hind III 双酶切连接了目的条带的T载体，同时也双酶切了pcDNA3.1-EGFP载体， 5、胶回收了酶切后的1.8k片段和pcDNA3.1-EGFP切开后的片段 6、T4连接酶过夜连接 7、转化、涂板后挑单克隆 8、菌落pcr鉴定，质粒提取鉴定 9、测序鉴定 接下来，我讲一下遇到的问题，在第8步的验证都非常正确，而测序的时候却总是不对，测序的结果显示是一堆大肠杆菌的基因组，我不知道问题出在什么地方，请各位高手指导一下。上传一下第八步的验证图供参考。另外，为什么pcDNA3.1-EGFP与目的片段连接效率怎么这么低呢？我挑了124个单克隆，只出来一个。  L12酶切和质粒酶切.jpg  PC3.1、L12酶切图.jpg  菌落PCR.jpg |
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