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[求助]
请问哪位可以帮帮我，看看问题出在哪里？
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最近我在用pcDNA3.1-EGFP载体与一个1.8k左右的片段连接，但连接了一个月了，还是没有连上，想请教一下大家问题出在哪里？ 首先，我讲一下我的实验流程： 1、设计引物扩增出该基因引物， 2、提取RNA，反转录成cDNA，PCR扩增目的片段 3、将目的片段胶回收后连入T载体，检验正确后测序 4、测序正确后，用EcoR I和Hind III 双酶切连接了目的条带的T载体，同时也双酶切了pcDNA3.1-EGFP载体， 5、胶回收了酶切后的1.8k片段和pcDNA3.1-EGFP切开后的片段 6、T4连接酶过夜连接 7、转化、涂板后挑单克隆 8、菌落pcr鉴定，质粒提取鉴定 9、测序鉴定 接下来，我讲一下遇到的问题，在第8步的验证都非常正确，而测序的时候却总是不对，测序的结果显示是一堆大肠杆菌的基因组，我不知道问题出在什么地方，请各位高手指导一下。上传一下第八步的验证图供参考。另外，为什么pcDNA3.1-EGFP与目的片段连接效率怎么这么低呢？我挑了124个单克隆，只出来一个。  L12酶切和质粒酶切.jpg  PC3.1、L12酶切图.jpg  菌落PCR.jpg |
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【答案】应助回帖
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137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-04 08:49:53
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-04 08:49:53
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一百多个得到一个，效率太低了，而且可能转到细胞内表达都是问题。如果是我的话，我会选择从头开始，如果时间安排紧凑三五天就可以完成。 很明显你的L12没有任何问题， pcDNA3.1-EGFP质粒最好重新转化一下，得到新制备的质粒进行酶切。可以选择一个引物测一下质粒，保证没有任何问题。 菌落pcr有时得到很多的假阳性，有时未连接的产物混到了菌落的周围，得到了错误的信号。 下次如果要做的话，PCR鉴定对的，提取质粒做个酶切，检测一下你的插入片段能不能被切下来 祝好运 |
7楼2013-07-04 00:48:40
2楼2013-06-12 23:32:43
3楼2013-06-13 07:52:20
4楼2013-06-13 08:43:17