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PET28a重组质粒酶切后有三条？ 已有3人参与
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酶切体系： 质粒 6 μl 10*Buufer 1 μl bamH1 0.5 μl sal1 0.5 μl ddH2O 2 μl 37℃酶切1.5h 酶切结果如图片 条带顺序： 右边开始依次为：marker 酶切前、酶切后，依次类推共28 个样。此后两个样为空载酶切前，空载酶切后。 问题：1、为什么酶切后大多数成3条带（目的片段中没有上述酶切位点）？ 2、酶切前的质粒条带为什么比酶切后的条带还要小？ 请各位高手指点迷津，谢谢！！！  ２０１４０0306meiqiejianding.jpg |
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youlinglyw
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你的问题 1载体酶切后一般是两部分，一大一小，如果总是三部分，不排除你的质粒上发生了突变，产生新的位点 2质粒环状跑得快，线性载体跑得慢。切开后，往往会出现质粒大小在中间，载体在上面，目的片段在下面的情况 额外说点 1 我觉得你的体系小了点。 我作载体酶切，一般都是十几二十的质粒，然后酶量也少了些，多加点 毕竟酶切后，电泳上样要多点 2 貌似你的电泳效果不好 可能问题是制胶问题，以及电泳液不干净 3 我经常过夜酶切 |
2楼2014-03-07 10:42:41
【答案】应助回帖
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第一个问题：一种是你双酶切体系问题，酶切不完全，存在未被双切的质粒，所以有3条带；还有一种可能就是质粒上碱基发生了突变，产生一个BamHl或者Sall的酶切位点（这个可能性很小）。 第二个问题：质粒被切成线性，比未切之前（超螺旋）跑的慢是没有问题的。质粒有三种构型。第一种是共价闭合环状DNA(covalently close circular DNA，ccc DNA)，它的两条链都保持完整的环状结构，通常呈超螺旋构型。第二种是开环DNA(open circularDNA，oc DNA)，它的双链中的一条保持完整的环状结构，另一条单链上有一到几个切口。第三种是线状DNA，这种质粒的双链断裂呈线状。这三种构型的同一种质粒在琼脂糖凝胶中电泳时，出现不同的迁移速率，走得最快的是超螺旋构型，其次是线性构型，最慢的是开环构型。 PS:楼主的双酶切体系模板量太大，10ul总体系太小，建议重新更换体系试试。 |
3楼2014-03-07 12:43:57
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youlinglyw
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其实都是一些琐碎问题。 鉴定体系跟你差不多吧，最多翻个倍，时间我一般切6小时以上 制胶的时候，胶溶解好后，自然冷却到6、7十度，然后倒胶，胶浓度选择好，这个网上有参考 电泳时候，初始先用100v左右跑个几分钟，让条带充分挤压后进入胶内。然后再用110或120v跑，电泳槽发热不要太明显 还有，你的酶切效率似乎不高，或者说，你的酶存在多个酶切位点。 buffer的选择也是有讲究的。另外，两个酶不一定是1:1 你最好看看你的酶在这个buffer里效率如何 我记得有个t-buffer，是个很神奇的buffer |
7楼2014-03-09 10:50:47
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