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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切切出来三条带
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19900628

铜虫 (正式写手)

[交流] 双酶切切出来三条带

用PflmI和BglI双酶切，400左右的是目的条带，可为什么会有两条很亮的条带12bp，1400bp左右的在上面？质粒应该靠3000bp左右的。三条带加一起与原始质粒大小感觉差不多。Marker大小为5000,3000,2000,1500,1200,750,500,250,100
双酶切切出来三条带
Administrator 2013-09-23 10hr 20min.jpg
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1楼2013-09-23 11:05:15
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RUI1990

银虫 (小有名气)
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19900628: 金币+1 2013-09-23 15:17:07
有可能其中一种酶切位点有两个，结果就切出三条带！
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2楼2013-09-23 11:32:15
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19900628

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by RUI1990 at 2013-09-23 11:32:15
有可能其中一种酶切位点有两个，结果就切出三条带！

确定就只有一个酶切位点。。。而且上面两个好亮
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3楼2013-09-23 11:40:27
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跳舞的骆驼

金虫 (初入文坛)
用的是什么质粒
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5楼2013-09-23 12:12:21
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desheng101

木虫 (正式写手)
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19900628: 金币+1 2013-09-23 15:16:52
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-09-26 15:10:03
建议楼主，做个单酶切，和原质粒的电泳图，楼主确定只有一个酶切位点吗？
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6楼2013-09-23 15:04:09
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bonbonzd

木虫 (小有名气)
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19900628: 金币+1 2013-09-23 15:16:45
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-09-26 15:10:10
可能是没有完全酶切开，最下面的会不会是超螺旋质粒，建议楼主做一下单酶切，然后和未酶切的质粒一块电泳看看
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7楼2013-09-23 15:12:42
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19900628

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by bonbonzd at 2013-09-23 15:12:42
可能是没有完全酶切开，最下面的会不会是超螺旋质粒，建议楼主做一下单酶切，然后和未酶切的质粒一块电泳看看

单酶切的也做的，在另外的图上，单酶切是对的，就一条带，大小也差不多。最下面的就是我要的条带，就是比较小。。。
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8楼2013-09-23 15:16:03
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19900628

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 跳舞的骆驼 at 2013-09-23 12:12:21
用的是什么质粒

用的是pUC19的载体
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9楼2013-09-23 15:16:33
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19900628

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by bonbonzd at 2013-09-23 15:12:42
可能是没有完全酶切开，最下面的会不会是超螺旋质粒，建议楼主做一下单酶切，然后和未酶切的质粒一块电泳看看

应该不会是没切开，我在切了四个小时的时候取了5ul跑电泳结果和这个差不多，这个是切了十几个小时的，而且我的双酶切是分步酶切的，先plfmI单酶切，跑的电泳没问题，然后再BglI单酶切的。以前也有切过三个小时的，那个时候的条带有四五条，所以这个图应该不是没切开。而且我的三条带加一起喝原始质粒的大小差不多的。
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10楼2013-09-23 15:20:25
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19900628

铜虫 (正式写手)
第一个是Marker，第二个是质粒，第三个是单酶切的，第四个就是双酶切的，单酶切应该没问题，就是双酶切还是三条带。。。各位大神给分析下啊~~
双酶切切出来三条带-1
Administrator 2013-09-23 19hr 06min.jpg
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11楼2013-09-23 18:43:45
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lifuzhu3838

金虫 (小有名气)
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-26 15:12:45
19900628: 金币+2 2013-09-26 21:12:34
有几个问题交流一下，第一、plfmI这个酶我没用过，也没有找到，在PUC19上也没有看到（我狗眼瞎了？Bgl I也没有注意到）；第二，这个Bgl I的酶切好像特异性不是很强的样子，不知道楼主有没有仔细比对过其他地方有没有GCCNNNNNGGC的序列。感觉疑点很多啊，不过我和很多虫友一样的看法，一个酶切了两个位点
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13楼2013-09-24 12:02:30
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19900628

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by lifuzhu3838 at 2013-09-24 12:02:30
有几个问题交流一下，第一、plfmI这个酶我没用过，也没有找到，在PUC19上也没有看到（我狗眼瞎了？Bgl I也没有注意到）；第二，这个Bgl I的酶切好像特异性不是很强的样子，不知道楼主有没有仔细比对过其他地方有没有 ...

写错了，是PflMI酶，还有PflMI和BglI这两个酶在pUC19上是没有的，是我加进去的，在我的目的片段和载体之间，然后我要用这两个酶给切下来，就是我的目的片段了，所以不会有两个位点的问题。质粒也给测过序了，是对的。现在我就是和目的片段相近的先切下来，试着连接一下看吧。
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14楼2013-09-24 13:04:08
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lifuzhu3838

金虫 (小有名气)
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19900628: 金币+3 2013-09-24 17:01:19
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-26 15:12:55
引用回帖:
14楼: Originally posted by 19900628 at 2013-09-24 13:04:08
写错了，是PflMI酶，还有PflMI和BglI这两个酶在pUC19上是没有的，是我加进去的，在我的目的片段和载体之间，然后我要用这两个酶给切下来，就是我的目的片段了，所以不会有两个位点的问题。质粒也给测过序了，是对的 ...

你是要做连接，那其实即使切出多条带也没有关系的，回收你目的位置的条带，可以考虑往下做。不过，这个Bgl I切出来的粘性末端，还是要自己加的酶切位点和目的载体上的酶切位点一致才好连接。
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15楼2013-09-24 13:31:03
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19900628

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by lifuzhu3838 at 2013-09-24 13:31:03
你是要做连接，那其实即使切出多条带也没有关系的，回收你目的位置的条带，可以考虑往下做。不过，这个Bgl I切出来的粘性末端，还是要自己加的酶切位点和目的载体上的酶切位点一致才好连接。...

是啊，就先回收了往下做，这个连接的位点问题都研究过了，理论上还是可以连上的。之前连接挑了好多单菌落，都没连上，现在试试去磷酸化后再连，再连不上，真不知道要怎么办了。。。。
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16楼2013-09-24 17:02:58
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lifuzhu3838

金虫 (小有名气)
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-26 15:13:03
19900628: 金币+2 2013-09-26 21:12:48
引用回帖:
16楼: Originally posted by 19900628 at 2013-09-24 17:02:58
是啊，就先回收了往下做，这个连接的位点问题都研究过了，理论上还是可以连上的。之前连接挑了好多单菌落，都没连上，现在试试去磷酸化后再连，再连不上，真不知道要怎么办了。。。。...

大概知道你的思路了，不知道是不是这样：从公司合成的序列，加好了酶切位点，拿来酶切，然后就可以连接了。关于这个有一个问题，如果你添加的Bgl I的酶切位点和目的载体上的酶切位点一致，就肯定可以连上的，不是什么理论可以。转化后得到很多假阳性做去磷酸化是很有道理的。如果还是不行，方法还是有很多的，不就是做一个克隆么，简单的。设计引物改改酶切位点，想放哪里放哪里。
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17楼2013-09-24 22:54:44
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19900628

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by lifuzhu3838 at 2013-09-24 22:54:44
大概知道你的思路了，不知道是不是这样：从公司合成的序列，加好了酶切位点，拿来酶切，然后就可以连接了。关于这个有一个问题，如果你添加的Bgl I的酶切位点和目的载体上的酶切位点一致，就肯定可以连上的，不是什 ...

嗯啊，继续连接~
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18楼2013-09-25 09:32:41
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xjtu0025

新虫 (小有名气)
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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-09-26 15:13:11
19900628: 金币+1 2013-09-26 21:13:01
lz,我们老师说过，跑所有的酶切图必须有单酶切双酶切，未酶切三条带，不然任何问题都说明不了。建议你一起切然后一起跑了再说。。。
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19楼2013-09-25 20:47:31
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lifuzhu3838

金虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
19楼: Originally posted by xjtu0025 at 2013-09-25 20:47:31
lz,我们老师说过，跑所有的酶切图必须有单酶切双酶切，未酶切三条带，不然任何问题都说明不了。建议你一起切然后一起跑了再说。。。

这个，我质疑一下你们老师。按他这个道理必须要有4条泳道对比。1、未酶切的；2、A酶单酶切；3、B酶单酶切；4、双酶切。其实楼主说他做过单酶切的时候我就想问是不是用的PflMI酶，如果用Bgl I，估计不好说（猜测一下）
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20楼2013-09-27 00:13:48
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白菜吃虫

铜虫 (小有名气)
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-27 17:18:26
楼主，你的单酶切咋就一个呀，另一个呢，两个酶分别单酶切的结果是啥样的啊。
你质粒和单酶切的电泳怎么这么像，按说3KB的质粒和单酶切片段的差异挺明显的啊，质粒条带应该再往下。而且一般情况下质粒2条带正常吧。当然可能你跑时间比较短，还看不出差别。
目的片段大小差不多400，收了直接连，载体大片段脱磷
祝好运！！
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21楼2013-09-27 03:27:10
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19900628

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
20楼: Originally posted by lifuzhu3838 at 2013-09-27 00:13:48
这个，我质疑一下你们老师。按他这个道理必须要有4条泳道对比。1、未酶切的；2、A酶单酶切；3、B酶单酶切；4、双酶切。其实楼主说他做过单酶切的时候我就想问是不是用的PflMI酶，如果用Bgl I，估计不好说（猜测一下 ...

我知道为什么了，其实应该是有四条带的，可能有个没看到，因为pUC19上面是有Bgl I的，而且还是两个。。。。都是粗心惹的祸
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22楼2013-09-29 12:32:46
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19900628

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
20楼: Originally posted by lifuzhu3838 at 2013-09-27 00:13:48
这个，我质疑一下你们老师。按他这个道理必须要有4条泳道对比。1、未酶切的；2、A酶单酶切；3、B酶单酶切；4、双酶切。其实楼主说他做过单酶切的时候我就想问是不是用的PflMI酶，如果用Bgl I，估计不好说（猜测一下 ...

而且很奇怪，我这个单酶切是Bgl I的，看不出明显变化，可是应该是有变化的啊，因为上面有这个酶切位点的，但是PflMI单酶切的就很明显的有差别的一条带。
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23楼2013-09-29 12:34:49
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19900628

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
21楼: Originally posted by 白菜吃虫 at 2013-09-27 03:27:10
楼主，你的单酶切咋就一个呀，另一个呢，两个酶分别单酶切的结果是啥样的啊。
你质粒和单酶切的电泳怎么这么像，按说3KB的质粒和单酶切片段的差异挺明显的啊，质粒条带应该再往下。而且一般情况下质粒2条带正常吧。 ...

这个是Bgl I单酶切的图，不知道为什没变化不大，PflMI单酶切的图倒是很明显的有差别的一条带，没问题的。
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24楼2013-09-29 12:35:54
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白菜吃虫

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
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19900628: 金币+3 2013-09-30 10:42:31
引用回帖:
24楼: Originally posted by 19900628 at 2013-09-29 12:35:54
这个是Bgl I单酶切的图，不知道为什没变化不大，PflMI单酶切的图倒是很明显的有差别的一条带，没问题的。...

又看了你的单切图，应该是没切动，上面甚至还有超螺旋。你换个Bgl1，别是酶失效了。
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25楼2013-09-29 22:57:02
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19900628

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
25楼: Originally posted by 白菜吃虫 at 2013-09-29 22:57:02
又看了你的单切图，应该是没切动，上面甚至还有超螺旋。你换个Bgl1，别是酶失效了。...

恩恩，下次换个试试看，至少有目的条带就行。
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26楼2013-09-30 10:42:21
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xl_dut

木虫 (正式写手)
★
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从电泳结果和楼上各位的分析来看，肯定是其中有一个酶在质粒的不同位置切了两下。
请问楼主是用公用buffer一步进行双酶切的吗？如果是的话，可能是公用buffer下某个酶有较强的Star活性。
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27楼2013-09-30 21:50:59
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WOAIDACHANG

禁言 (正式写手)
★
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本帖内容被屏蔽
28楼2014-08-22 17:05:26
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仁者努力

铁虫 (正式写手)
★
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你的载体上有几个pflm I和bglI啊 你最好看一下是不是还有这两个酶切位点 有可能还有这两个酶切位点 所以又切下来一段
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29楼2014-08-23 10:43:24
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19900628

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
28楼: Originally posted by WOAIDACHANG at 2014-08-22 17:05:26
我前几天就遇到过这种事，酶切切出三条带，后来发现是质粒污染了。

知道就好了。
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30楼2014-08-25 09:22:25
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19900628

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
29楼: Originally posted by 仁者努力 at 2014-08-23 10:43:24
你的载体上有几个pflm I和bglI啊 你最好看一下是不是还有这两个酶切位点 有可能还有这两个酶切位点 所以又切下来一段

是的啊，有的，所以切的条带是对的。
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31楼2014-08-25 09:22:53
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
★
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会不会有同尾酶啊什么的？
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32楼2014-08-25 14:39:49
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huaxiduan4楼
2013-09-23 11:53   回复  
westlife91112楼
2013-09-23 19:12   回复  
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