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微微右旋

金虫 (正式写手)

[求助] HInd III EcoR I双酶切问题

小弟用8f 1510 扩增细菌16SrDNA 进行TA克隆 菌落PCR后用HInd III  EcoR I这两种酶切,但结果有点想不明白!求指教!不胜感激!
PS: 第一条泳道是1200bp的Maker
        第二条泳道为EcoR I 单酶切  
     第三条泳道为HInd III 单酶切
     第四条泳道为EcoR I 和HInd III 双酶切
反应体系按照Takara 标准体系 PCR产物5ul
问题  为什么单酶切有三条带子  而双酶切就两条  求解?
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微微右旋

金虫 (正式写手)

2楼2012-10-21 23:32:48
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励应助 2012-10-30 15:50:55
上一个菌落PCR产物的对照再看看。你是否分析了目的基因上这两个酶的酶切位点,好像是把插入片段给切成两个片段了。一般是菌落PCR鉴定阳性克隆后摇菌提质粒后再做酶切鉴定。
3楼2012-10-21 23:43:44
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jiangyinshen

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-10-30 15:51:08
分子克隆的结果很难讲,有的时候偶然性很大,会出一些难以解释的奇怪结果,你再重复两遍,如果还是这样子的话再来讨论,否则没有意义
不是風動,亦非幡動,仁者心動
4楼2012-10-22 09:34:23
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-22 13:38:53
楼主为什么不做一个酶切前产物的电泳作对照呢?个人认为EcoRI可以切开,但是HindIII没有切开,也许是因为HindIII的酶切效率比较低吧。楼主酶切时间多长呢?EcoRI的酶切效率比较高,我觉得可以分开切,然后适当增加HindIII的酶切时间看看。
keepon
5楼2012-10-22 10:30:24
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匿名

用户注销 (文坛精英)

本帖仅楼主可见
6楼2012-10-25 14:29:54
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piaoying_jys

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

一次结果不足为据,至少还要重复两次,如果还是这样子的,才有统计学意义
但愿人长久,千里共婵娟
7楼2012-10-25 15:32:08
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lanjb1013

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

为啥要酶切?pcr筛选后,测序就可以了。
8楼2012-10-25 16:25:08
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lanjb1013

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

为啥要酶切了?菌落pcr后,测序就可以了,你的目的是啥了?
9楼2012-10-25 16:26:12
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微微右旋

金虫 (正式写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by lanjb1013 at 2012-10-25 16:26:12
为啥要酶切了?菌落pcr后,测序就可以了,你的目的是啥了?

200多个克隆,其中有很多是一样的,要是直接测序,费用较大,所以酶切后压缩测序量,将不同OTU的克隆拿去测序。
10楼2012-10-27 23:00:24
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