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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » HInd III EcoR I双酶切问题
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微微右旋

金虫 (正式写手)

[求助] HInd III EcoR I双酶切问题

小弟用8f 1510 扩增细菌16SrDNA 进行TA克隆 菌落PCR后用HInd III  EcoR I这两种酶切，但结果有点想不明白！求指教！不胜感激！
PS： 第一条泳道是1200bp的Maker
        第二条泳道为EcoR I 单酶切  
     第三条泳道为HInd III 单酶切
     第四条泳道为EcoR I 和HInd III 双酶切
反应体系按照Takara 标准体系 PCR产物5ul
问题  为什么单酶切有三条带子  而双酶切就两条  求解？
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    • 2012-10-21 22:45:45, 2.66 M

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1楼 2012-10-21 22:51:02
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微微右旋

金虫 (正式写手)
2楼2012-10-21 23:32:48
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励应助 2012-10-30 15:50:55
上一个菌落PCR产物的对照再看看。你是否分析了目的基因上这两个酶的酶切位点，好像是把插入片段给切成两个片段了。一般是菌落PCR鉴定阳性克隆后摇菌提质粒后再做酶切鉴定。
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3楼2012-10-21 23:43:44
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jiangyinshen

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-10-30 15:51:08
分子克隆的结果很难讲，有的时候偶然性很大，会出一些难以解释的奇怪结果，你再重复两遍，如果还是这样子的话再来讨论，否则没有意义
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不是風動，亦非幡動，仁者心動
4楼2012-10-22 09:34:23
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-22 13:38:53
楼主为什么不做一个酶切前产物的电泳作对照呢？个人认为EcoRI可以切开，但是HindIII没有切开，也许是因为HindIII的酶切效率比较低吧。楼主酶切时间多长呢？EcoRI的酶切效率比较高，我觉得可以分开切，然后适当增加HindIII的酶切时间看看。
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keepon
5楼2012-10-22 10:30:24
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匿名

用户注销 (文坛精英)
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6楼2012-10-25 14:29:54
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piaoying_jys

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

一次结果不足为据，至少还要重复两次，如果还是这样子的，才有统计学意义
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但愿人长久，千里共婵娟
7楼2012-10-25 15:32:08
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lanjb1013

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

为啥要酶切？pcr筛选后，测序就可以了。
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8楼2012-10-25 16:25:08
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lanjb1013

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

为啥要酶切了？菌落pcr后，测序就可以了，你的目的是啥了？
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9楼2012-10-25 16:26:12
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微微右旋

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by lanjb1013 at 2012-10-25 16:26:12
为啥要酶切了？菌落pcr后，测序就可以了，你的目的是啥了？

200多个克隆，其中有很多是一样的，要是直接测序，费用较大，所以酶切后压缩测序量，将不同OTU的克隆拿去测序。
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10楼2012-10-27 23:00:24
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