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tongxinkxy

银虫 (小有名气)

[求助] Sac II,EcoR I,Ssp I三酶切问题

一环形质粒,红色为我的目的片段,要获得这个目的片段,设置了3个酶切位点(如果双酶切的话,目的基因和T载体酶切后电泳无法分开)
但是目前3个酶各自酶切均可以,但是3酶切或者任何两个酶双酶切均失败
原本计划为:
首先用Sac II, Ssp I双酶切得到2100和3400bp片段,预想获得3400bp片段后,胶回收再用 EcoR I 单酶切获得600和2800bp的目的片段,但是首先双酶切就没有成功
Sac II, Ssp I双酶切体系为 :
酶各1 T缓冲液 2 BSA 2 质粒 0.6ug 加水到20  (TAKARA的)

如果说单酶切一次一次切的话,胶回收的浓度不够下次及下下次酶切浓度,是否有好的浓缩DNA的方法?
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amilie030312

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

tongxinkxy(金币+3): 2011-11-28 15:28:14
话说这三种都能用Buffer4酶切的,不用一次切一个回收,换个公司的酶试试看吧。
另外,没有切成功是没切开还是没切完全啊?
2楼2011-11-28 13:32:56
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zc10052157

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

tongxinkxy(金币+3): 2011-11-28 15:28:20
为什么不PCR这个基因
hold住
3楼2011-11-28 13:45:20
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tongxinkxy

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by amilie030312 at 2011-11-28 13:32:56:
话说这三种都能用Buffer4酶切的,不用一次切一个回收,换个公司的酶试试看吧。
另外,没有切成功是没切开还是没切完全啊?

takara 没有buffer4吧,是一点都没有切开

单酶切都可以完全切开
就是放在一起切不开
4楼2011-11-28 15:26:41
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tongxinkxy

银虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by zc10052157 at 2011-11-28 13:45:20:
为什么不PCR这个基因

由于手里没有高保真的酶,所以想着就直接用质粒上连好的基因
若是PCR的话,就是Sac II,EcoR I的双酶切,我也试过了,也没有成功
5楼2011-11-28 15:28:03
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amilie030312

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

tongxinkxy(金币+3): 2011-11-28 16:01:06
直接告诉你,换个品牌试试
6楼2011-11-28 15:42:39
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yjingmo

木虫 (著名写手)

修筑

【答案】应助回帖

tongxinkxy(金币+3): 2011-11-28 16:01:13
tongxinkxy(金币+3): 2011-11-28 16:18:51
为什么ECR和Sac双酶切会没切开呢?不能啊 ?确定你的酶没有污染?质粒提的够干净?缓冲体系也没问题吧?
如果我成功了,那么我比别人幸运;如果我失败了,那么我还不够努力!
7楼2011-11-28 15:50:07
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tongxinkxy

银虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by yjingmo at 2011-11-28 15:50:07:
为什么ECR和Sac双酶切会没切开呢?不能啊 ?确定你的酶没有污染?质粒提的够干净?缓冲体系也没问题吧?

为什么会这么问呢?是这两个酶很好切吗?
您有已经用过的体系吗?
8楼2011-11-28 16:00:48
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yjingmo

木虫 (著名写手)

修筑

【答案】应助回帖

tongxinkxy(金币+3): 2011-11-28 16:18:43
挺好切的啊,你先确保自己的东西都没问题
如果我成功了,那么我比别人幸运;如果我失败了,那么我还不够努力!
9楼2011-11-28 16:07:54
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tongxinkxy

银虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by yjingmo at 2011-11-28 16:07:54:
挺好切的啊,你先确保自己的东西都没问题

质粒量和纯度都够,您有体系可以让我借鉴一下吗?
10楼2011-11-28 16:18:35
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