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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » Sac II,EcoR I,Ssp I三酶切问题
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tongxinkxy

银虫 (小有名气)

[求助] Sac II,EcoR I,Ssp I三酶切问题

一环形质粒，红色为我的目的片段，要获得这个目的片段，设置了3个酶切位点（如果双酶切的话，目的基因和T载体酶切后电泳无法分开）
但是目前3个酶各自酶切均可以，但是3酶切或者任何两个酶双酶切均失败
原本计划为：
首先用Sac II, Ssp I双酶切得到2100和3400bp片段，预想获得3400bp片段后，胶回收再用 EcoR I 单酶切获得600和2800bp的目的片段，但是首先双酶切就没有成功
Sac II, Ssp I双酶切体系为 ：
酶各1 T缓冲液 2 BSA 2 质粒 0.6ug 加水到20  （TAKARA的）

如果说单酶切一次一次切的话，胶回收的浓度不够下次及下下次酶切浓度，是否有好的浓缩DNA的方法？
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1楼 2011-11-28 10:32:18
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amilie030312

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

tongxinkxy(金币+3): 2011-11-28 15:28:14
话说这三种都能用Buffer4酶切的，不用一次切一个回收，换个公司的酶试试看吧。
另外，没有切成功是没切开还是没切完全啊？
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2楼2011-11-28 13:32:56
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zc10052157

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

tongxinkxy(金币+3): 2011-11-28 15:28:20
为什么不PCR这个基因
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hold住
3楼2011-11-28 13:45:20
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tongxinkxy

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by amilie030312 at 2011-11-28 13:32:56:
话说这三种都能用Buffer4酶切的，不用一次切一个回收，换个公司的酶试试看吧。
另外，没有切成功是没切开还是没切完全啊？

takara 没有buffer4吧，是一点都没有切开

单酶切都可以完全切开
就是放在一起切不开
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4楼2011-11-28 15:26:41
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tongxinkxy

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zc10052157 at 2011-11-28 13:45:20:
为什么不PCR这个基因

由于手里没有高保真的酶，所以想着就直接用质粒上连好的基因
若是PCR的话，就是Sac II,EcoR I的双酶切，我也试过了，也没有成功
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5楼2011-11-28 15:28:03
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amilie030312

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

tongxinkxy(金币+3): 2011-11-28 16:01:06
直接告诉你，换个品牌试试
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6楼2011-11-28 15:42:39
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yjingmo

木虫 (著名写手)

修筑

【答案】应助回帖

tongxinkxy(金币+3): 2011-11-28 16:01:13
tongxinkxy(金币+3): 2011-11-28 16:18:51
为什么ECR和Sac双酶切会没切开呢？不能啊 ？确定你的酶没有污染？质粒提的够干净？缓冲体系也没问题吧？
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如果我成功了，那么我比别人幸运；如果我失败了，那么我还不够努力！
7楼2011-11-28 15:50:07
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tongxinkxy

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by yjingmo at 2011-11-28 15:50:07:
为什么ECR和Sac双酶切会没切开呢？不能啊 ？确定你的酶没有污染？质粒提的够干净？缓冲体系也没问题吧？

为什么会这么问呢？是这两个酶很好切吗？
您有已经用过的体系吗？
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8楼2011-11-28 16:00:48
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yjingmo

木虫 (著名写手)

修筑

【答案】应助回帖

tongxinkxy(金币+3): 2011-11-28 16:18:43
挺好切的啊，你先确保自己的东西都没问题
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如果我成功了，那么我比别人幸运；如果我失败了，那么我还不够努力！
9楼2011-11-28 16:07:54
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tongxinkxy

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by yjingmo at 2011-11-28 16:07:54:
挺好切的啊，你先确保自己的东西都没问题

质粒量和纯度都够，您有体系可以让我借鉴一下吗？
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10楼2011-11-28 16:18:35
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