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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » PET28a重组质粒酶切后有三条？
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1296785943

铁虫 (初入文坛)

[求助] PET28a重组质粒酶切后有三条？ 已有3人参与

酶切体系：
            质粒                     6 μl
           10*Buufer             1 μl
           bamH1                0.5 μl
           sal1                     0.5 μl
           ddH2O                   2 μl
   37℃酶切1.5h
  
酶切结果如图片

条带顺序：
右边开始依次为：marker  酶切前、酶切后，依次类推共28 个样。此后两个样为空载酶切前，空载酶切后。

问题：1、为什么酶切后大多数成3条带（目的片段中没有上述酶切位点）？
           2、酶切前的质粒条带为什么比酶切后的条带还要小？


请各位高手指点迷津，谢谢！！！
PET28a重组质粒酶切后有三条？
２０１４０0306meiqiejianding.jpg
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1楼 2014-03-07 10:34:23
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liulugang

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-03-31 15:31:51
第一个问题：一种是你双酶切体系问题，酶切不完全，存在未被双切的质粒，所以有3条带；还有一种可能就是质粒上碱基发生了突变，产生一个BamHl或者Sall的酶切位点（这个可能性很小）。
第二个问题：质粒被切成线性，比未切之前（超螺旋）跑的慢是没有问题的。质粒有三种构型。第一种是共价闭合环状DNA(covalently close circular DNA，ccc DNA)，它的两条链都保持完整的环状结构，通常呈超螺旋构型。第二种是开环DNA(open circularDNA，oc DNA)，它的双链中的一条保持完整的环状结构，另一条单链上有一到几个切口。第三种是线状DNA，这种质粒的双链断裂呈线状。这三种构型的同一种质粒在琼脂糖凝胶中电泳时，出现不同的迁移速率，走得最快的是超螺旋构型，其次是线性构型，最慢的是开环构型。

PS:楼主的双酶切体系模板量太大，10ul总体系太小，建议重新更换体系试试。
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3楼2014-03-07 12:43:57
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youlinglyw

荣誉版主 (著名写手)

一匡天下

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-07 12:02:01
1296785943: 金币+5, ★有帮助 2014-03-09 10:01:50
你的问题
1载体酶切后一般是两部分，一大一小，如果总是三部分，不排除你的质粒上发生了突变，产生新的位点
2质粒环状跑得快，线性载体跑得慢。切开后，往往会出现质粒大小在中间，载体在上面，目的片段在下面的情况

额外说点
1 我觉得你的体系小了点。
我作载体酶切，一般都是十几二十的质粒，然后酶量也少了些，多加点
毕竟酶切后，电泳上样要多点
2 貌似你的电泳效果不好
可能问题是制胶问题，以及电泳液不干净
3 我经常过夜酶切
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天行健
2楼2014-03-07 10:42:41
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-03-31 15:31:40
你的胶跑的不清楚，没有拍摄清楚，没有调节清楚模糊的那个按键吧？
跑胶时间太短了，marker 都还没分开。
1.酶切后大多数成3条带，说明你的载体上 bamH1、sal1其中的一个酶有2个酶切位点。        或者，你没有酶切完全，这样就有3条带：质粒（单酶切的）、载体、目的片段。
质粒 6 μl大约是多少ng？bamH1  0.5 μl+ sal10.5 μl切的是<=500ng的质粒。.
2.同2.3楼。
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4楼2014-03-07 15:02:31
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1296785943

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by youlinglyw at 2014-03-07 10:42:41
你的问题
1载体酶切后一般是两部分，一大一小，如果总是三部分，不排除你的质粒上发生了突变，产生新的位点
2质粒环状跑得快，线性载体跑得慢。切开后，往往会出现质粒大小在中间，载体在上面，目的片段在下面的情 ...

1、一般你们做重组后双酶切鉴定的体系是多大、各组分是多少？可以参考下吗！
2、电泳效果不好，制胶的过程应该注意哪些细节问题，可以传授下吗？
3、我之前对载体过双酶切时间上的优化，图片如下：从右至左，依次为maker、酶切1h、1.5h、2h、2.5h。我的载体上BamH1、Sal1都只有一个酶切位点。是不是酶的特异性不好？综合其他方面的原因，我只能选这两种酶，就这个问题能给点建议吗？
PET28a重组质粒酶切后有三条？-1
2014021６酶切条件xiami.jpg
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5楼2014-03-09 10:32:38
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