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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » PET28a重组质粒酶切后有三条？
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1296785943

铁虫 (初入文坛)

[求助] PET28a重组质粒酶切后有三条？ 已有3人参与

酶切体系：
            质粒                     6 μl
           10*Buufer             1 μl
           bamH1                0.5 μl
           sal1                     0.5 μl
           ddH2O                   2 μl
   37℃酶切1.5h
  
酶切结果如图片

条带顺序：
右边开始依次为：marker  酶切前、酶切后，依次类推共28 个样。此后两个样为空载酶切前，空载酶切后。

问题：1、为什么酶切后大多数成3条带（目的片段中没有上述酶切位点）？
           2、酶切前的质粒条带为什么比酶切后的条带还要小？


请各位高手指点迷津，谢谢！！！
PET28a重组质粒酶切后有三条？
２０１４０0306meiqiejianding.jpg
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1楼 2014-03-07 10:34:23
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youlinglyw

荣誉版主 (著名写手)

一匡天下

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-07 12:02:01
1296785943: 金币+5, ★有帮助 2014-03-09 10:01:50
你的问题
1载体酶切后一般是两部分，一大一小，如果总是三部分，不排除你的质粒上发生了突变，产生新的位点
2质粒环状跑得快，线性载体跑得慢。切开后，往往会出现质粒大小在中间，载体在上面，目的片段在下面的情况

额外说点
1 我觉得你的体系小了点。
我作载体酶切，一般都是十几二十的质粒，然后酶量也少了些，多加点
毕竟酶切后，电泳上样要多点
2 貌似你的电泳效果不好
可能问题是制胶问题，以及电泳液不干净
3 我经常过夜酶切
赞一下 回复此楼
天行健
2楼2014-03-07 10:42:41
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youlinglyw

荣誉版主 (著名写手)

一匡天下

优秀版主
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-31 15:32:03
引用回帖:
5楼: Originally posted by 1296785943 at 2014-03-09 10:32:38
1、一般你们做重组后双酶切鉴定的体系是多大、各组分是多少？可以参考下吗！
2、电泳效果不好，制胶的过程应该注意哪些细节问题，可以传授下吗？
3、我之前对载体过双酶切时间上的优化，图片如下：从右至左，依次 ...

其实都是一些琐碎问题。
鉴定体系跟你差不多吧，最多翻个倍，时间我一般切6小时以上
制胶的时候，胶溶解好后，自然冷却到6、7十度，然后倒胶，胶浓度选择好，这个网上有参考
电泳时候，初始先用100v左右跑个几分钟，让条带充分挤压后进入胶内。然后再用110或120v跑，电泳槽发热不要太明显

还有，你的酶切效率似乎不高，或者说，你的酶存在多个酶切位点。

buffer的选择也是有讲究的。另外，两个酶不一定是1:1
你最好看看你的酶在这个buffer里效率如何

我记得有个t-buffer，是个很神奇的buffer
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天行健
7楼2014-03-09 10:50:47
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