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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » XhoI和BamHI双酶切问题
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1049131934

铜虫 (小有名气)

[求助] XhoI和BamHI双酶切问题 已有1人参与

本人用的质粒是pET-28a，限制性酶XhoI和BamHI两个酶进行酶切连接目的基因，目的基因连接上了，但是在进行双酶切检测时，出现了一个比目的基因大，比质粒小的条带，有没有人明白这是怎么回事儿？

[ Last edited by silicare on 2014-2-18 at 08:54 ]
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1楼 2013-09-23 21:48:16
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

2008101111

金虫 (正式写手)

学术江湖混子

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-27 16:15:46
如果酶切不能确定菌液的阳性，可以进行菌液PCR鉴定，如果PCR有阳性结果，直接送测序就OK了，祝成功
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自主创业者，捣腾生物试剂
6楼2013-09-26 17:50:58
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1049131934

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 沙门小rna at 2013-12-05 01:44:12
过夜37？好吧。我知道是可以的。不过一般过夜我们都是4度的。37就4个小时。...

好吧，谢谢，我是两个基因同时重组进质粒，我已经利用三酶切体系成功了
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16楼2013-12-07 16:32:48
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普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-27 16:15:29
跑质粒对照了吗？会不会是酶切不完全的质粒？
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2楼2013-09-23 22:14:15
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RUI1990

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-26 20:42:10
以载体质粒双酶切为对照，看是否能切出一条相同大小的条带，再比对目的片段大小。酶切时适当时间长一点，保证酶切充分，便于分析。
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做自己
3楼2013-09-24 11:12:52
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shyh1983

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-26 20:42:16
1.考虑是否酶切不完全，可适当延长酶切时间；2.考虑是否质粒浓度太高，适当减少质粒用量；3.考虑双酶切所用的buffer是否为此2种酶的通用buffer？
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4楼2013-09-24 11:46:33
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Da果冻

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我也出现了相同的问题，我测序也没测出来，你测个序看看是不是连上你的目的条带了
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一个人的存在
5楼2013-09-24 15:59:58
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白菜吃虫

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-27 16:15:57
连接啥可能都有，所以多弄几个克隆进行验证
PCR验证最好是载体片段上引物序列
酶切验证也可以选择载体上的酶切位点来验证
最后一定测序验证
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7楼2013-09-27 03:32:02
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biology-boy

禁虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-27 16:16:05
本帖内容被屏蔽
8楼2013-09-27 13:04:57
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沙门小rna

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-27 16:16:12
酶切的过程很重要。请问你切了多久？，温度和puffer呢？据我所知，酶切用的酶在长时间和buffer有问题的时候会产生其他切口。就是酶切出其他的特定序列。你可以百度下酶切的星号活性
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应助之星就是我~没错。你没有看错~
9楼2013-09-27 14:53:16
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黑盖儿

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-18 11:51:46
首先，在酶切鉴定之前先做一次菌液PCR，如果结果呈阳性，再进行酶切。
其次，认真检查一下你用的质粒上面是不是不止一个XhoI或BamHI酶切位点。
最后，看看你XhoI和BamHI两种酶的公用Buffer是不是合适，两种酶在这种公用Buffer里面的活性怎样。
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我给不了你宝马香车，锦衣玉食，但我会用一辈子去疼你，爱你，保护你
10楼2013-10-08 11:59:30
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