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铁虫 (初入文坛)

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[求助] PET28a重组质粒酶切后有三条？已有3人参与

酶切体系：
         质粒                   6 μl
         10*Buufer          1 μl
         bamH1             0.5 μl
         sal1                   0.5 μl
         ddH2O                2 μl
37℃酶切1.5h

酶切结果如图片

条带顺序：
右边开始依次为：marker  酶切前、酶切后，依次类推共28 个样。此后两个样为空载酶切前，空载酶切后。

问题：1、为什么酶切后大多数成3条带（目的片段中没有上述酶切位点）？
         2、酶切前的质粒条带为什么比酶切后的条带还要小？

请各位高手指点迷津，谢谢！！！

２０１４０0306meiqiejianding.jpg

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1楼 2014-03-07 10:34:23

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liulugang

木虫 (小有名气)

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专业: 生物化学

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-03-31 15:31:51

第一个问题：一种是你双酶切体系问题，酶切不完全，存在未被双切的质粒，所以有3条带；还有一种可能就是质粒上碱基发生了突变，产生一个BamHl或者Sall的酶切位点（这个可能性很小）。
第二个问题：质粒被切成线性，比未切之前（超螺旋）跑的慢是没有问题的。质粒有三种构型。第一种是共价闭合环状DNA(covalently close circular DNA，ccc DNA)，它的两条链都保持完整的环状结构，通常呈超螺旋构型。第二种是开环DNA(open circularDNA，oc DNA)，它的双链中的一条保持完整的环状结构，另一条单链上有一到几个切口。第三种是线状DNA，这种质粒的双链断裂呈线状。这三种构型的同一种质粒在琼脂糖凝胶中电泳时，出现不同的迁移速率，走得最快的是超螺旋构型，其次是线性构型，最慢的是开环构型。

PS:楼主的双酶切体系模板量太大，10ul总体系太小，建议重新更换体系试试。

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