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fxj1986

木虫 (正式写手)

[交流] 酶切酶连转化后单克隆检测不对

自己构建的载体，片段7K左右；片段（3k）通过PCR扩增；电泳后回收进行酶切，酶切条件37℃，3h；再电泳后回收，酶连时载体：片段=1:1.5左右，转化DH5α，16h（氯霉素抗性）平板上单克隆很多；挑取单克隆进行菌落PCR验证（引物为自己设计），电泳结果显示除了目的条带外还有其他条带；对单克隆培养重新提取质粒进行双酶切后，只检测出一条带（与质粒大小基本一致），没有片段的目的条带。几次转化都如此，求分析，求经验！
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1楼 2012-10-12 15:52:01
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
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fxj1986: 金币+1 2012-10-13 10:26:43
首先确保用的两个酶没问题。酶切完用碱性磷酸酶处理载体减少自连。菌落PCR时做负对照。
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5楼2012-10-13 08:41:03
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kk26

木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
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fxj1986: 金币+1, 谢谢，同勉 2012-10-12 22:34:40
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-13 16:30:16
做过以未连入片段的质粒为模板的阴性对照PCR吗？怀疑你没有连入片段，pcr筛菌出来的并非阳性克隆。

我目前也筛不到阳性克隆，同样郁闷，继续做做！
同祝好运！
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2楼2012-10-12 17:28:17
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酶切专家

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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fxj1986: 金币+3, 谢谢 2012-10-12 22:35:36
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-13 16:30:30
应该是载体酶切不完全（没有完全进行双酶切）。不知道你用的是什么酶。不同酶的用量会差5-30倍。你可以用double digestion designer设计你的酶切实验，确保载体酶切完全，基本没有背景克隆。你可以在小木虫上搜到的。祝好运。
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3楼2012-10-12 20:32:41
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faile18

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
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fxj1986: 金币+1, 引物是一样的，正在改变酶切条件 2012-10-13 10:26:32
小丹木木: 金币+3, 光路交流 2012-10-13 16:30:40
小丹木木: 操作失误，不好意思 2012-10-13 16:31:02
有点疑问，也有点小建议：
1. 可以考虑蓝白斑筛选，初步滤掉空载体，白色克隆PCR检测，（这里有个疑问，你PCR验证时说引物自己设计，不知道你这对引物与你之前PCR扩增3K片段时是否一样，如果不一样可以考虑用那对引物扩增来检测一下）。
2. 确定下质粒双酶切体系是否兼容，比如buffer，酶用量等都会有影响。
3. 你的载体自身是否work？
祝好运。
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4楼2012-10-13 04:15:23
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