应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切酶连转化后单克隆检测不对
51/1返回列表
查看: 1747  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

fxj1986

木虫 (正式写手)

[交流] 酶切酶连转化后单克隆检测不对

自己构建的载体，片段7K左右；片段（3k）通过PCR扩增；电泳后回收进行酶切，酶切条件37℃，3h；再电泳后回收，酶连时载体：片段=1:1.5左右，转化DH5α，16h（氯霉素抗性）平板上单克隆很多；挑取单克隆进行菌落PCR验证（引物为自己设计），电泳结果显示除了目的条带外还有其他条带；对单克隆培养重新提取质粒进行双酶切后，只检测出一条带（与质粒大小基本一致），没有片段的目的条带。几次转化都如此，求分析，求经验！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2012-10-12 15:52:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

酶切专家

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fxj1986: 金币+3, 谢谢 2012-10-12 22:35:36
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-13 16:30:30
应该是载体酶切不完全（没有完全进行双酶切）。不知道你用的是什么酶。不同酶的用量会差5-30倍。你可以用double digestion designer设计你的酶切实验，确保载体酶切完全，基本没有背景克隆。你可以在小木虫上搜到的。祝好运。
赞一下 回复此楼
3楼2012-10-12 20:32:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 9 个回答

kk26

木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fxj1986: 金币+1, 谢谢，同勉 2012-10-12 22:34:40
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-13 16:30:16
做过以未连入片段的质粒为模板的阴性对照PCR吗？怀疑你没有连入片段，pcr筛菌出来的并非阳性克隆。

我目前也筛不到阳性克隆，同样郁闷，继续做做！
同祝好运！
赞一下 回复此楼
2楼2012-10-12 17:28:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

faile18

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fxj1986: 金币+1, 引物是一样的，正在改变酶切条件 2012-10-13 10:26:32
小丹木木: 金币+3, 光路交流 2012-10-13 16:30:40
小丹木木: 操作失误，不好意思 2012-10-13 16:31:02
有点疑问，也有点小建议：
1. 可以考虑蓝白斑筛选，初步滤掉空载体，白色克隆PCR检测，（这里有个疑问，你PCR验证时说引物自己设计，不知道你这对引物与你之前PCR扩增3K片段时是否一样，如果不一样可以考虑用那对引物扩增来检测一下）。
2. 确定下质粒双酶切体系是否兼容，比如buffer，酶用量等都会有影响。
3. 你的载体自身是否work？
祝好运。
赞一下 回复此楼
4楼2012-10-13 04:15:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fxj1986: 金币+1 2012-10-13 10:26:43
首先确保用的两个酶没问题。酶切完用碱性磷酸酶处理载体减少自连。菌落PCR时做负对照。
赞一下 回复此楼
5楼2012-10-13 08:41:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 9 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 321求调剂 +6 wasdssaa 2026-03-26 6/300 2026-03-26 20:57 by sanrepian
[考研] 325求调剂 +3 李嘉图·S·路 2026-03-23 3/150 2026-03-26 20:37 by sanrepian
[考研] 材料调剂 +7 匹克i 2026-03-23 7/350 2026-03-26 19:00 by 不吃魚的貓
[考研] 274求调剂 +14 顾九笙要谦虚 2026-03-24 20/1000 2026-03-26 18:15 by 乐呵呵的追梦人
[考研] 一志愿哈工大，085400，320，求调剂 +4 gdlf9999 2026-03-24 4/200 2026-03-25 23:01 by boxking200
[考研] 308求调剂 +5 墨墨漠 2026-03-25 5/250 2026-03-25 22:19 by 544594351
[考研] 299求调剂 +7 某某某某位 2026-03-21 8/400 2026-03-25 20:34 by 热情沙漠
[考研] 材料调剂 +3 iwinso 2026-03-23 3/150 2026-03-25 11:29 by greychen00
[考研] 307求调剂 +3 余意卿 2026-03-21 6/300 2026-03-24 15:03 by 余意卿
[考研] 求调剂一志愿武汉理工大学材料工程（085601） +5 WW.' 2026-03-23 7/350 2026-03-24 14:50 by sprinining
[考研] 361求调剂 +3 Glack 2026-03-22 3/150 2026-03-23 22:03 by fuyu_
[考研] 一志愿东华大学化学070300，求调剂 +7 2117205181 2026-03-21 8/400 2026-03-22 22:55 by chixmc
[考研] 324求调剂 +6 lucky呀呀呀鸭 2026-03-20 6/300 2026-03-22 16:01 by ColorlessPI
[考研] 材料学硕301分求调剂 +7 Liyouyumairs 2026-03-21 7/350 2026-03-21 22:31 by peike
[考研] 0703化学调剂 +4 妮妮ninicgb 2026-03-21 4/200 2026-03-21 18:39 by 学员8dgXkO
[考研] 332求调剂 +3 凤凰院丁真 2026-03-20 3/150 2026-03-21 10:27 by luoyongfeng
[考研] 085601调剂 358分 +3 zzzzggh 2026-03-20 4/200 2026-03-21 10:21 by luoyongfeng
[考研] 南昌大学材料专硕311分求调剂 +6 77chaselx 2026-03-20 6/300 2026-03-21 07:24 by JourneyLucky
[考研] 一志愿 南京航空航天大学大学 ，080500材料科学与工程学硕 +5 @taotao 2026-03-20 5/250 2026-03-20 20:16 by JourneyLucky
[考研] 求调剂 +3 @taotao 2026-03-20 3/150 2026-03-20 19:35 by JourneyLucky
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭