| 查看: 5570 | 回复: 3 | ||
zeroon木虫 (正式写手)
|
[求助]
关于连接、转化、挑取单克隆的问题 已有3人参与
|
|
情况是这样的。以puc19为载体，在其多克隆位点插入一个片段，转化后挑取单克隆验证。在平板上挑取了将近100个单菌，才找到一个正确插入了外援片段的。有没有方法能更快更好的选择出来那些真正有插入片段的啊？ 毕竟在连接的时候，多克隆位点那里会产生自连，到不是因为没有去磷酸化，因为多克隆位点双酶切后去磷酸化也没用啊，两种酶切，一个是kpn1，另一个是xho1。 上面是第一个问题。 第二个问题是，挑出了一个单克隆，放小瓶培养后，送样测序，结果返回的结果是 非单克隆现象。 也就是说，小瓶培养的菌里面有转入puc19质粒的，因为都能在amp抗性培养基里生长。现在没法子，只好继续在amp固体培养基筛选挑单菌了。问题来了，有没有更简单的方法快速挑出转化子呢？ 第三个问题属于延伸类，有没有可能在转化的时候，puc19和puc19+目的片段，这两种质粒一起转入一个大肠杆菌中，这样一个菌里面，有两种质粒，那这怎么样都没法挑出单克隆来了，对不对？ 问题不难，拜托各位大神了，小弟在此谢过了！ |
回复此楼» 猜你喜欢
解密度鲁特韦——新一代HIV整合酶抑制剂的化学、药理与产业化图景
已经有0人回复
-
左炔诺孕酮从沃氏氧化物到炔基化反应的工艺迭代与靶点解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有97人回复
-
“关闭瘙痒信号”的多肽地非法林醋酸盐全解析
已经有1人回复
-
Tosylate-DPA-714介导¹⁸F-DPA-714 PET成像的前沿进展
已经有0人回复
-
I-BRD9: BRD9溴结构域化学探针，BET选择性>700倍
已经有0人回复
-
莫那利珠单抗阻断NKG2A/HLA-E抑制通路 | Biochempartner
已经有0人回复
-
GSPT1口服分子胶降解剂MRT-2359 | Biochempartner
已经有0人回复
-
碳青霉烯类抗生素为何需联用西司他丁钠？ | Biochempartner
已经有0人回复
-
源自蕨类植物的抗炎美白活性分子去甲氧基荚果蕨素 | Biochempartner
已经有0人回复
-
肠道里的"代谢开关"：Fexaramine用肠道限制性重新定义 FXR 激动剂
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 急 分子克隆遇到问题
已经有9人回复
- 克隆时卡那筛选菌落
已经有7人回复
- PCR片段连接载体，转化不出阳性克隆，求解?
已经有14人回复
- 关于PCR产物胶回收连T载的问题～
已经有7人回复
- 感受态转化及阳性克隆出现问题
已经有15人回复
- 挑单克隆后摇菌摇不起来的问题
已经有22人回复
- 挑取单克隆后的PCR验证
已经有3人回复
- 10电泳条带 跑成这样是怎么回事
已经有4人回复
- 平板能长，挑单克隆却不长啊啊啊啊啊
已经有12人回复
- 基因与载体连接转化后涂版长出了菌，提质粒却没有提出来，不知道什么原因？？
已经有17人回复
- 转化后单克隆都一样吗
已经有13人回复
- 酶切酶连转化后单克隆检测不对
已经有8人回复
- 挑单克隆后，菌液PCR检测所有条带都偏小，目的条带没有出现
已经有9人回复
- 转化后菌液PCR鉴定，没有目的条带
已经有15人回复
- 双酶切后载体片段变小
已经有8人回复
- 目的片段与载体连接后无法检测出
已经有7人回复
- 16S rDNA测序问题
已经有21人回复
- 连接转化后挑菌落，测序是混合克隆，是怎么回事？
已经有9人回复
- 大肠杆菌基因重组时PKD46高温怎么都消除不了
已经有25人回复
- 转化遭遇红霉素对大肠杆菌失效！
已经有13人回复
- 【求助/交流】T载体转化挑单克隆加的LB培养基里加抗生素么
已经有6人回复
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zeroon: 金币+15, ★★★很有帮助, 谢谢 2015-04-01 23:21:10
zeroon: 金币+5, ★有帮助, 看到小哥头像很帅，再加5分 2015-04-01 23:38:57
感谢参与，应助指数 +1
zeroon: 金币+15, ★★★很有帮助, 谢谢 2015-04-01 23:21:10
zeroon: 金币+5, ★有帮助, 看到小哥头像很帅，再加5分 2015-04-01 23:38:57
|
第一个问题：双酶切一般假阳性率很低的，载体双酶切后回收切开的链状载体，目的片段也是双酶切，然后连接转化，一般能在抗性平板上生长的绝大部分都是阳性克隆的，如果只是为了测序，建议使用TA克隆，要想快速筛的阳性克隆可以外加蓝白斑筛选； 第二个问题：挑菌斑的时候绝对挑取单菌落，挑取不同菌斑避免交叉污染，一般不会出现非单克隆现象的，同样的要快速挑出转化子。可以做蓝白斑筛选； 第三个问题：质粒具有排异性，一般一个细菌细胞只能转化一种质粒，类似于受精过程，一个卵细胞只接受一个精子，当然也有些专门用作转化多个质粒的工程质粒和工程菌除外。 个人见解 |
2楼2015-04-01 17:57:48
3楼2015-04-01 18:13:06
4楼2015-04-02 09:40:53
