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zeroon木虫 (正式写手)
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关于连接、转化、挑取单克隆的问题 已有3人参与
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情况是这样的。以puc19为载体，在其多克隆位点插入一个片段，转化后挑取单克隆验证。在平板上挑取了将近100个单菌，才找到一个正确插入了外援片段的。有没有方法能更快更好的选择出来那些真正有插入片段的啊？ 毕竟在连接的时候，多克隆位点那里会产生自连，到不是因为没有去磷酸化，因为多克隆位点双酶切后去磷酸化也没用啊，两种酶切，一个是kpn1，另一个是xho1。 上面是第一个问题。 第二个问题是，挑出了一个单克隆，放小瓶培养后，送样测序，结果返回的结果是 非单克隆现象。 也就是说，小瓶培养的菌里面有转入puc19质粒的，因为都能在amp抗性培养基里生长。现在没法子，只好继续在amp固体培养基筛选挑单菌了。问题来了，有没有更简单的方法快速挑出转化子呢？ 第三个问题属于延伸类，有没有可能在转化的时候，puc19和puc19+目的片段，这两种质粒一起转入一个大肠杆菌中，这样一个菌里面，有两种质粒，那这怎么样都没法挑出单克隆来了，对不对？ 问题不难，拜托各位大神了，小弟在此谢过了！ |
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3楼2015-04-01 18:13:06
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第一个问题：双酶切一般假阳性率很低的，载体双酶切后回收切开的链状载体，目的片段也是双酶切，然后连接转化，一般能在抗性平板上生长的绝大部分都是阳性克隆的，如果只是为了测序，建议使用TA克隆，要想快速筛的阳性克隆可以外加蓝白斑筛选； 第二个问题：挑菌斑的时候绝对挑取单菌落，挑取不同菌斑避免交叉污染，一般不会出现非单克隆现象的，同样的要快速挑出转化子。可以做蓝白斑筛选； 第三个问题：质粒具有排异性，一般一个细菌细胞只能转化一种质粒，类似于受精过程，一个卵细胞只接受一个精子，当然也有些专门用作转化多个质粒的工程质粒和工程菌除外。 个人见解 |
2楼2015-04-01 17:57:48
4楼2015-04-02 09:40:53
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