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xiongyaoling金虫 (小有名气)
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连接转化后挑菌落，测序是混合克隆，是怎么回事？
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| 最近在做原核表达载体的构建。连接转化后，菌落PCR鉴定为阳性的单菌落送测序后，结果说是混合克隆是怎么一回事，什么是混合克隆？混合克隆能分离出含有目的基因的单克隆吗？还请各位多多指教？ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 很认真的解答，分析的很全面 2012-07-13 16:02:46
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 很认真的解答，分析的很全面 2012-07-13 16:02:46
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这可能有2种情况。 一种是你看到的“单菌落”有2个甚至多个菌，这样如果你PCR有阳性结果的话（要有阴性对照）再划线分离应该是可以分出来的。 第二种就是菌里含有多个载体，虽说有载体之间不相容之说，但这也是存在的情况，我转酵母的时候也碰到过类似的问题。 个人认为： 在转化后得到克隆了，应该从以下几个方面来验证： 1.PCR，不仅要有目标片段的PCR验证，还要将载体上得引物与片段上得引物互相配合来进行菌落PCR验证，同时要有阴性对照。 2.PCR出来阳性结果后只能说明你的菌里有你需要的，这个时候需要接菌提质粒，再进行酶切鉴定，如果与载体和目标片段的大小相符，那应该就可以送测序了。有其它条带就要好好分析了。 所以个人意见在PCR得到阳性结果后不要直接往下做或测序。因为PCR结果并不是100%确定。要不做到后面出问题了分析都不知从何来起。 |
7楼2012-07-13 09:17:22
shenye.judy
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2楼2012-07-11 11:09:40
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4楼2012-07-12 21:54:04
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beishui
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