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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接转化后挑菌落，测序是混合克隆，是怎么回事？
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xiongyaoling

金虫 (小有名气)

[求助] 连接转化后挑菌落，测序是混合克隆，是怎么回事？

最近在做原核表达载体的构建。连接转化后，菌落PCR鉴定为阳性的单菌落送测序后，结果说是混合克隆是怎么一回事，什么是混合克隆？混合克隆能分离出含有目的基因的单克隆吗？还请各位多多指教？
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1楼 2012-07-11 09:02:45
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回帖置顶 ( 共有1个 )

陈年芬芳

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 很认真的解答，分析的很全面 2012-07-13 16:02:46
这可能有2种情况。
一种是你看到的“单菌落”有2个甚至多个菌，这样如果你PCR有阳性结果的话（要有阴性对照）再划线分离应该是可以分出来的。
第二种就是菌里含有多个载体，虽说有载体之间不相容之说，但这也是存在的情况，我转酵母的时候也碰到过类似的问题。
个人认为：
在转化后得到克隆了，应该从以下几个方面来验证：
1.PCR，不仅要有目标片段的PCR验证，还要将载体上得引物与片段上得引物互相配合来进行菌落PCR验证，同时要有阴性对照。
2.PCR出来阳性结果后只能说明你的菌里有你需要的，这个时候需要接菌提质粒，再进行酶切鉴定，如果与载体和目标片段的大小相符，那应该就可以送测序了。有其它条带就要好好分析了。
所以个人意见在PCR得到阳性结果后不要直接往下做或测序。因为PCR结果并不是100%确定。要不做到后面出问题了分析都不知从何来起。
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7楼2012-07-13 09:17:22
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普通回帖

shenye.judy

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-11 13:49:05
就是说你的菌里，可能有2个以上载体，或者一个菌落，其实混有2种以上菌。
要不你转化的时候少放点载体？或者涂板子的时候涂开些？板子用大些的？不要等菌长的很大才去挑，只要肉眼看得见菌斑，就可以挑了，一长大，有时候是几个菌斑混着的。
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2楼2012-07-11 11:09:40
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xiongyaoling

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shenye.judy at 2012-07-11 11:09:40
就是说你的菌里，可能有2个以上载体，或者一个菌落，其实混有2种以上菌。
要不你转化的时候少放点载体？或者涂板子的时候涂开些？板子用大些的？不要等菌长的很大才去挑，只要肉眼看得见菌斑，就可以挑了，一长大， ...

谢谢，我再试试！
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3楼2012-07-11 22:20:48
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xiongyaoling

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shenye.judy at 2012-07-11 11:09:40
就是说你的菌里，可能有2个以上载体，或者一个菌落，其实混有2种以上菌。
要不你转化的时候少放点载体？或者涂板子的时候涂开些？板子用大些的？不要等菌长的很大才去挑，只要肉眼看得见菌斑，就可以挑了，一长大， ...

你是说菌里可能同时含有空载体和含有目的基因的载体吗，想问下质粒不是有不相溶性的吗？
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4楼2012-07-12 21:54:04
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tupac225

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-13 16:10:07
你的这种问题，很常见的，菌落pcr的假阳性很高，要保证pcr的真阳性，必须从你的目的载体上设计引物进行pcr，然后进行目的片段的pcr，双重筛选。
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coasttocoast。
5楼2012-07-12 22:16:28
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xiongyaoling

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by tupac225 at 2012-07-12 22:16:28
你的这种问题，很常见的，菌落pcr的假阳性很高，要保证pcr的真阳性，必须从你的目的载体上设计引物进行pcr，然后进行目的片段的pcr，双重筛选。

学习了,谢谢!
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6楼2012-07-13 08:59:56
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xiongyaoling

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 陈年芬芳 at 2012-07-13 09:17:22
这可能有2种情况。
一种是你看到的“单菌落”有2个甚至多个菌，这样如果你PCR有阳性结果的话（要有阴性对照）再划线分离应该是可以分出来的。
第二种就是菌里含有多个载体，虽说有载体之间不相容之说，但这也是存 ...

有道理，谢谢，我做PCR的时候有做阴性对照，对照在目的基因大小处也有浅浅的带，不知道是为什么？试剂应该没有污染。
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8楼2012-07-13 10:23:44
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skuy1223

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议楼主做菌落PCR不要只使用与目的基因匹配的引物，还应该使用载体的引物试一下。如果使用载体引物得到的序列不是目的基因的序列就可以肯定该菌落不是单克隆。希望能帮助到你。
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努力！
9楼2012-07-13 22:24:16
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beishui

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

挑取单克隆，提质粒，酶切后从新链接转化，之后挑单菌，去质粒去测序
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宠辱不惊，看庭前花开花落；去留无意，望天上云卷云舒。
10楼2012-09-18 16:26:52
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