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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接转化后挑菌落，测序是混合克隆，是怎么回事？
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xiongyaoling

金虫 (小有名气)

[求助] 连接转化后挑菌落，测序是混合克隆，是怎么回事？

最近在做原核表达载体的构建。连接转化后，菌落PCR鉴定为阳性的单菌落送测序后，结果说是混合克隆是怎么一回事，什么是混合克隆？混合克隆能分离出含有目的基因的单克隆吗？还请各位多多指教？
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1楼 2012-07-11 09:02:45
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陈年芬芳

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 很认真的解答，分析的很全面 2012-07-13 16:02:46
这可能有2种情况。
一种是你看到的“单菌落”有2个甚至多个菌，这样如果你PCR有阳性结果的话（要有阴性对照）再划线分离应该是可以分出来的。
第二种就是菌里含有多个载体，虽说有载体之间不相容之说，但这也是存在的情况，我转酵母的时候也碰到过类似的问题。
个人认为：
在转化后得到克隆了，应该从以下几个方面来验证：
1.PCR，不仅要有目标片段的PCR验证，还要将载体上得引物与片段上得引物互相配合来进行菌落PCR验证，同时要有阴性对照。
2.PCR出来阳性结果后只能说明你的菌里有你需要的，这个时候需要接菌提质粒，再进行酶切鉴定，如果与载体和目标片段的大小相符，那应该就可以送测序了。有其它条带就要好好分析了。
所以个人意见在PCR得到阳性结果后不要直接往下做或测序。因为PCR结果并不是100%确定。要不做到后面出问题了分析都不知从何来起。
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7楼2012-07-13 09:17:22
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shenye.judy

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-11 13:49:05
就是说你的菌里，可能有2个以上载体，或者一个菌落，其实混有2种以上菌。
要不你转化的时候少放点载体？或者涂板子的时候涂开些？板子用大些的？不要等菌长的很大才去挑，只要肉眼看得见菌斑，就可以挑了，一长大，有时候是几个菌斑混着的。
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2楼2012-07-11 11:09:40
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xiongyaoling

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shenye.judy at 2012-07-11 11:09:40
就是说你的菌里，可能有2个以上载体，或者一个菌落，其实混有2种以上菌。
要不你转化的时候少放点载体？或者涂板子的时候涂开些？板子用大些的？不要等菌长的很大才去挑，只要肉眼看得见菌斑，就可以挑了，一长大， ...

谢谢，我再试试！
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3楼2012-07-11 22:20:48
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xiongyaoling

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shenye.judy at 2012-07-11 11:09:40
就是说你的菌里，可能有2个以上载体，或者一个菌落，其实混有2种以上菌。
要不你转化的时候少放点载体？或者涂板子的时候涂开些？板子用大些的？不要等菌长的很大才去挑，只要肉眼看得见菌斑，就可以挑了，一长大， ...

你是说菌里可能同时含有空载体和含有目的基因的载体吗，想问下质粒不是有不相溶性的吗？
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4楼2012-07-12 21:54:04
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