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yabing0324

金虫 (职业作家)


[交流] 【求助/交流】克隆-定量-测序,结果怪异

大家好,我做荧光定量PCR,绝对定量,要制备质粒标准品,在做蓝白斑筛选的时候没有加IPTG和x-gal,我挑取单个白斑,提质粒,普通PCR,扩出目的条带,然后系列梯度稀释,做定量,绘制标准曲线,结果还挺好,可是等我测序结果回来时候,惊呆了,居然是质粒的序列,难道是我目的片段没有连接上?如果没有连接上,PCR后电泳怎么出现了目的条带,而且我同时做了四个目的片段的重组质粒,仅有一个测出来是跟我做的菌具有100%的相似性,其他的都不是。到底怎么回事,正准备重新做,但是为了避免悲剧再次重现,还是想请各位给我点指导意见,这次克隆时肯定会加 IPTG和x-gal避免假阳性。
在此先谢谢各位关注小女小贴!
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yabing0324(金币+1): 2011-03-04 16:05:22
鉴定重组质粒最保险的方法是酶切鉴定。PCR不保险。
2楼2011-03-04 15:57:03
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yabing0324

金虫 (职业作家)


引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-03-04 15:57:03:
鉴定重组质粒最保险的方法是酶切鉴定。PCR不保险。

今天刚定了酶,准备切一下,这个对酶的要求高吗?请问你通常用哪家公司的,我想订生工的,不知道怎么样
3楼2011-03-04 16:07:17
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引用回帖:
Originally posted by yabing0324 at 2011-03-04 16:07:17:
今天刚定了酶,准备切一下,这个对酶的要求高吗?请问你通常用哪家公司的,我想订生工的,不知道怎么样

酶的要求不那么高,生工的没用过。用过Fermentas的。
4楼2011-03-04 16:13:36
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yabing0324

金虫 (职业作家)


大家帮帮可怜的我吧
5楼2011-03-04 22:26:30
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yabing0324

金虫 (职业作家)


引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-03-04 16:13:36:
酶的要求不那么高,生工的没用过。用过Fermentas的。

我订了fermentas的内切酶了,ECOR I,你能不能告诉我你用的体系,及保温多久?谢谢!
6楼2011-03-06 23:18:59
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引用回帖:
Originally posted by yabing0324 at 2011-03-06 23:18:59:
我订了fermentas的内切酶了,ECOR I,你能不能告诉我你用的体系,及保温多久?谢谢!

说明书上有,很详细的。
7楼2011-03-07 08:48:54
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leiyunting

木虫 (著名写手)


没有加IPTG和x-gal  那你挑中的白斑菌落,不是目的菌落可能性很大,我建议还是重做吧,第一步奠基都没好,后面的估计很悬
8楼2011-03-07 09:00:45
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yabing0324

金虫 (职业作家)


引用回帖:
Originally posted by leiyunting at 2011-03-07 09:00:45:
没有加IPTG和x-gal  那你挑中的白斑菌落,不是目的菌落可能性很大,我建议还是重做吧,第一步奠基都没好,后面的估计很悬

现在已经重新做了,可是提出的质粒质量还是不好,有四五条带,我知道三条带比较正常,可我的这么多条带,单酶切后应该是两条带,目的片段和载体,可是上面依然还有两条,郁闷啊!
9楼2011-03-07 19:47:12
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