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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】克隆-定量-测序，结果怪异
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yabing0324

金虫 (职业作家)

[交流] 【求助/交流】克隆-定量-测序，结果怪异

大家好，我做荧光定量PCR,绝对定量，要制备质粒标准品，在做蓝白斑筛选的时候没有加IPTG和x-gal，我挑取单个白斑，提质粒，普通PCR，扩出目的条带，然后系列梯度稀释，做定量，绘制标准曲线，结果还挺好，可是等我测序结果回来时候，惊呆了，居然是质粒的序列，难道是我目的片段没有连接上？如果没有连接上，PCR后电泳怎么出现了目的条带，而且我同时做了四个目的片段的重组质粒，仅有一个测出来是跟我做的菌具有100%的相似性，其他的都不是。到底怎么回事，正准备重新做，但是为了避免悲剧再次重现，还是想请各位给我点指导意见，这次克隆时肯定会加 IPTG和x-gal避免假阳性。
在此先谢谢各位关注小女小贴！
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1楼 2011-03-04 15:45:58
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susizheng

木虫 (著名写手)
yabing0324(金币+1): 2011-03-04 16:05:22
鉴定重组质粒最保险的方法是酶切鉴定。PCR不保险。
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2楼2011-03-04 15:57:03
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yabing0324

金虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-03-04 15:57:03:
鉴定重组质粒最保险的方法是酶切鉴定。PCR不保险。

今天刚定了酶，准备切一下，这个对酶的要求高吗？请问你通常用哪家公司的，我想订生工的，不知道怎么样
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3楼2011-03-04 16:07:17
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susizheng

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by yabing0324 at 2011-03-04 16:07:17:
今天刚定了酶，准备切一下，这个对酶的要求高吗？请问你通常用哪家公司的，我想订生工的，不知道怎么样

酶的要求不那么高，生工的没用过。用过Fermentas的。
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4楼2011-03-04 16:13:36
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yabing0324

金虫 (职业作家)
大家帮帮可怜的我吧
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5楼2011-03-04 22:26:30
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yabing0324

金虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-03-04 16:13:36:
酶的要求不那么高，生工的没用过。用过Fermentas的。

我订了fermentas的内切酶了，ECOR I，你能不能告诉我你用的体系，及保温多久？谢谢！
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6楼2011-03-06 23:18:59
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susizheng

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by yabing0324 at 2011-03-06 23:18:59:
我订了fermentas的内切酶了，ECOR I，你能不能告诉我你用的体系，及保温多久？谢谢！

说明书上有，很详细的。
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7楼2011-03-07 08:48:54
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leiyunting

木虫 (著名写手)
没有加IPTG和x-gal  那你挑中的白斑菌落，不是目的菌落可能性很大，我建议还是重做吧，第一步奠基都没好，后面的估计很悬
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8楼2011-03-07 09:00:45
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yabing0324

金虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by leiyunting at 2011-03-07 09:00:45:
没有加IPTG和x-gal  那你挑中的白斑菌落，不是目的菌落可能性很大，我建议还是重做吧，第一步奠基都没好，后面的估计很悬

现在已经重新做了，可是提出的质粒质量还是不好，有四五条带，我知道三条带比较正常，可我的这么多条带，单酶切后应该是两条带，目的片段和载体，可是上面依然还有两条，郁闷啊！
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9楼2011-03-07 19:47:12
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