应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】克隆-定量-测序，结果怪异
61/1返回列表
查看: 1309  |  回复: 8
查看全部回帖 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

yabing0324

金虫 (职业作家)

[交流] 【求助/交流】克隆-定量-测序，结果怪异

大家好，我做荧光定量PCR,绝对定量，要制备质粒标准品，在做蓝白斑筛选的时候没有加IPTG和x-gal，我挑取单个白斑，提质粒，普通PCR，扩出目的条带，然后系列梯度稀释，做定量，绘制标准曲线，结果还挺好，可是等我测序结果回来时候，惊呆了，居然是质粒的序列，难道是我目的片段没有连接上？如果没有连接上，PCR后电泳怎么出现了目的条带，而且我同时做了四个目的片段的重组质粒，仅有一个测出来是跟我做的菌具有100%的相似性，其他的都不是。到底怎么回事，正准备重新做，但是为了避免悲剧再次重现，还是想请各位给我点指导意见，这次克隆时肯定会加 IPTG和x-gal避免假阳性。
在此先谢谢各位关注小女小贴！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2011-03-04 15:45:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yabing0324

金虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-03-04 15:57:03:
鉴定重组质粒最保险的方法是酶切鉴定。PCR不保险。

今天刚定了酶，准备切一下，这个对酶的要求高吗？请问你通常用哪家公司的，我想订生工的，不知道怎么样
赞一下 回复此楼
3楼2011-03-04 16:07:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yabing0324

金虫 (职业作家)
大家帮帮可怜的我吧
赞一下 回复此楼
5楼2011-03-04 22:26:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yabing0324

金虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-03-04 16:13:36:
酶的要求不那么高，生工的没用过。用过Fermentas的。

我订了fermentas的内切酶了，ECOR I，你能不能告诉我你用的体系，及保温多久？谢谢！
赞一下 回复此楼
6楼2011-03-06 23:18:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yabing0324

金虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by leiyunting at 2011-03-07 09:00:45:
没有加IPTG和x-gal  那你挑中的白斑菌落，不是目的菌落可能性很大，我建议还是重做吧，第一步奠基都没好，后面的估计很悬

现在已经重新做了，可是提出的质粒质量还是不好，有四五条带，我知道三条带比较正常，可我的这么多条带，单酶切后应该是两条带，目的片段和载体，可是上面依然还有两条，郁闷啊！
赞一下 回复此楼
9楼2011-03-07 19:47:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 yabing0324 的主题更新
61/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭