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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接转化出现很多微小的菌落
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天鸟

木虫 (正式写手)

[求助] 连接转化出现很多微小的菌落 已有1人参与

首先我的PCR产物经过纯化，纯化DNA的图还是比较亮的。我连接的片段是400BP ，我连接的体系是：4微升DNA，1微升载体19-t,和solution I 5微升，在16度连接了3小时，图AMP+的平板后培养12小时发现菌落的大小不一致，大的菌旁边很多很小的菌落，菌落PCR验证发现阳性率只有50-70%，而且挑菌的时候也很不顺利，我挑的相对大些的菌落时，旁边就有小菌落。我这个重复做了两次，结果都差不多。平板也做了两批，也没有区别
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快乐生活，我快乐
1楼 2012-04-01 14:54:40
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回帖置顶 ( 共有1个 )

杨明波

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+3, Good！ 2012-04-01 17:56:44
西瓜: 回帖置顶 2012-04-01 17:56:46
不用担心，那些小菌落是卫星菌落，现在室温比较高，菌长得很快，建议加大抗生素使用浓度，或者是转化之后将单菌画线到另外一个抗性平板上，这样长出来的菌就比较好接种了，而且卫星菌落就不会长出来了。
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上善如水，厚德载物
6楼2012-04-01 16:10:57
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普通回帖

超然渡陈

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+3, 正解！ 2012-04-01 15:39:54
天鸟: 金币+1 2012-04-01 16:10:30
小的那些是卫星菌落。阳性克隆长一段时间以后周围的抗生素会降解，这样原来被抑制的假阳性菌就会生长而形成小的菌落。
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2楼2012-04-01 15:36:39
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hyacinth326

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
天鸟: 金币+1 2012-04-01 16:10:25
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-04-01 17:55:59
建议稍微提高一下抗生素的浓度，我前几天就遇到过这种情况，我那管amp用到最后剩200ul了，被我加到培养基里倒平板，也是出现很多卫星菌落，我一看就果断换了一管抗生素倒了平板，就好了~~~
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3楼2012-04-01 15:46:09
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wxy1989714

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
天鸟: 金币+1 2012-04-01 16:10:15
连接时间是不是短了点？16度才连3小时
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树叶飞舞，火之意志。
4楼2012-04-01 15:50:57
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匿名

用户注销 (著名写手)
★
感谢参与，应助指数 +1
天鸟: 金币+1 2012-04-01 16:10:09
本帖仅楼主可见
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5楼2012-04-01 16:04:14
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XOooZzz

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
天鸟: 金币+1 2012-04-02 09:04:20
正常，amp容易长卫星菌落，没事的。怕挑到杂菌的话你可以尽早挑菌，以后注意不要培养太久就是了。16度3h差不多了，400bp连t载体可以比较粗放，直接室温放个来小时就ok了。阳性率低估计和t载体的质量关系比较大。
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7楼2012-04-01 23:57:59
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天鸟

木虫 (正式写手)
问题是我要建库用的，这样的结果去建库感觉不是很好
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快乐生活，我快乐
8楼2012-04-02 09:07:09
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wanglei512

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 天鸟 at 2012-04-02 09:07:09:
问题是我要建库用的，这样的结果去建库感觉不是很好

阳性率低可能是感受态的问题，感受态效率好了，阳性率就高了。周围长出小菌，是培养的时间太长了，菌落差不多大小的时候，在4°冰箱放置上1h左右，蓝白斑非常明显。
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9楼2012-04-03 17:21:53
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sdluqun

铁杆木虫 (著名写手)

板砖队长

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议两个：1.Amp的机制是抑菌，因此可以提高抗生素浓度，100ug/ml；2.缩短培养时间。不知道LZ有没有同时做载体自连的对照，如果没有，建议增加，就大体知道假阳性的概率了。
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尔非我焉知我悲喜
10楼2012-04-04 10:20:50
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