24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
查看: 3328  |  回复: 14

天鸟

木虫 (正式写手)

[求助] 连接转化出现很多微小的菌落已有1人参与

首先我的PCR产物经过纯化,纯化DNA的图还是比较亮的。我连接的片段是400BP ,我连接的体系是:4微升DNA,1微升载体19-t,和solution I 5微升,在16度连接了3小时,图AMP+的平板后培养12小时发现菌落的大小不一致,大的菌旁边很多很小的菌落,菌落PCR验证发现阳性率只有50-70%,而且挑菌的时候也很不顺利,我挑的相对大些的菌落时,旁边就有小菌落。我这个重复做了两次,结果都差不多。平板也做了两批,也没有区别
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

快乐生活,我快乐
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

超然渡陈

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西瓜: 金币+3, 正解! 2012-04-01 15:39:54
天鸟: 金币+1 2012-04-01 16:10:30
小的那些是卫星菌落。阳性克隆长一段时间以后周围的抗生素会降解,这样原来被抑制的假阳性菌就会生长而形成小的菌落。
2楼2012-04-01 15:36:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hyacinth326

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
天鸟: 金币+1 2012-04-01 16:10:25
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-04-01 17:55:59
建议稍微提高一下抗生素的浓度,我前几天就遇到过这种情况,我那管amp用到最后剩200ul了,被我加到培养基里倒平板,也是出现很多卫星菌落,我一看就果断换了一管抗生素倒了平板,就好了~~~
3楼2012-04-01 15:46:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wxy1989714

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
天鸟: 金币+1 2012-04-01 16:10:15
连接时间是不是短了点?16度才连3小时
树叶飞舞,火之意志。
4楼2012-04-01 15:50:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

用户注销 (著名写手)


感谢参与,应助指数 +1
天鸟: 金币+1 2012-04-01 16:10:09
本帖仅楼主可见
5楼2012-04-01 16:04:14
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

杨明波

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西瓜: 金币+3, Good! 2012-04-01 17:56:44
西瓜: 回帖置顶 2012-04-01 17:56:46
不用担心,那些小菌落是卫星菌落,现在室温比较高,菌长得很快,建议加大抗生素使用浓度,或者是转化之后将单菌画线到另外一个抗性平板上,这样长出来的菌就比较好接种了,而且卫星菌落就不会长出来了。
上善如水,厚德载物
6楼2012-04-01 16:10:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

XOooZzz

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
天鸟: 金币+1 2012-04-02 09:04:20
正常,amp容易长卫星菌落,没事的。怕挑到杂菌的话你可以尽早挑菌,以后注意不要培养太久就是了。16度3h差不多了,400bp连t载体可以比较粗放,直接室温放个来小时就ok了。阳性率低估计和t载体的质量关系比较大。
7楼2012-04-01 23:57:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

天鸟

木虫 (正式写手)

问题是我要建库用的,这样的结果去建库感觉不是很好
快乐生活,我快乐
8楼2012-04-02 09:07:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wanglei512

金虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 天鸟 at 2012-04-02 09:07:09:
问题是我要建库用的,这样的结果去建库感觉不是很好

阳性率低可能是感受态的问题,感受态效率好了,阳性率就高了。周围长出小菌,是培养的时间太长了,菌落差不多大小的时候,在4°冰箱放置上1h左右,蓝白斑非常明显。
9楼2012-04-03 17:21:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sdluqun

铁杆木虫 (著名写手)

板砖队长

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
建议两个:1.Amp的机制是抑菌,因此可以提高抗生素浓度,100ug/ml;2.缩短培养时间。不知道LZ有没有同时做载体自连的对照,如果没有,建议增加,就大体知道假阳性的概率了。
尔非我焉知我悲喜
10楼2012-04-04 10:20:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 天鸟 的主题更新
信息提示
请填处理意见