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天鸟

木虫 (正式写手)

[求助] 连接转化出现很多微小的菌落 已有1人参与

首先我的PCR产物经过纯化,纯化DNA的图还是比较亮的。我连接的片段是400BP ,我连接的体系是:4微升DNA,1微升载体19-t,和solution I 5微升,在16度连接了3小时,图AMP+的平板后培养12小时发现菌落的大小不一致,大的菌旁边很多很小的菌落,菌落PCR验证发现阳性率只有50-70%,而且挑菌的时候也很不顺利,我挑的相对大些的菌落时,旁边就有小菌落。我这个重复做了两次,结果都差不多。平板也做了两批,也没有区别
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快乐生活,我快乐
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XOooZzz

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
天鸟: 金币+1 2012-04-02 09:04:20
正常,amp容易长卫星菌落,没事的。怕挑到杂菌的话你可以尽早挑菌,以后注意不要培养太久就是了。16度3h差不多了,400bp连t载体可以比较粗放,直接室温放个来小时就ok了。阳性率低估计和t载体的质量关系比较大。
7楼2012-04-01 23:57:59
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超然渡陈

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西瓜: 金币+3, 正解! 2012-04-01 15:39:54
天鸟: 金币+1 2012-04-01 16:10:30
小的那些是卫星菌落。阳性克隆长一段时间以后周围的抗生素会降解,这样原来被抑制的假阳性菌就会生长而形成小的菌落。
2楼2012-04-01 15:36:39
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hyacinth326

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
天鸟: 金币+1 2012-04-01 16:10:25
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-04-01 17:55:59
建议稍微提高一下抗生素的浓度,我前几天就遇到过这种情况,我那管amp用到最后剩200ul了,被我加到培养基里倒平板,也是出现很多卫星菌落,我一看就果断换了一管抗生素倒了平板,就好了~~~
3楼2012-04-01 15:46:09
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wxy1989714

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
天鸟: 金币+1 2012-04-01 16:10:15
连接时间是不是短了点?16度才连3小时
树叶飞舞,火之意志。
4楼2012-04-01 15:50:57
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