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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接转化出现很多微小的菌落
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天鸟

木虫 (正式写手)

[求助] 连接转化出现很多微小的菌落 已有1人参与

首先我的PCR产物经过纯化，纯化DNA的图还是比较亮的。我连接的片段是400BP ，我连接的体系是：4微升DNA，1微升载体19-t,和solution I 5微升，在16度连接了3小时，图AMP+的平板后培养12小时发现菌落的大小不一致，大的菌旁边很多很小的菌落，菌落PCR验证发现阳性率只有50-70%，而且挑菌的时候也很不顺利，我挑的相对大些的菌落时，旁边就有小菌落。我这个重复做了两次，结果都差不多。平板也做了两批，也没有区别
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快乐生活，我快乐
1楼 2012-04-01 14:54:40
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XOooZzz

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
天鸟: 金币+1 2012-04-02 09:04:20
正常，amp容易长卫星菌落，没事的。怕挑到杂菌的话你可以尽早挑菌，以后注意不要培养太久就是了。16度3h差不多了，400bp连t载体可以比较粗放，直接室温放个来小时就ok了。阳性率低估计和t载体的质量关系比较大。
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7楼2012-04-01 23:57:59
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超然渡陈

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+3, 正解！ 2012-04-01 15:39:54
天鸟: 金币+1 2012-04-01 16:10:30
小的那些是卫星菌落。阳性克隆长一段时间以后周围的抗生素会降解，这样原来被抑制的假阳性菌就会生长而形成小的菌落。
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2楼2012-04-01 15:36:39
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hyacinth326

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
天鸟: 金币+1 2012-04-01 16:10:25
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-04-01 17:55:59
建议稍微提高一下抗生素的浓度，我前几天就遇到过这种情况，我那管amp用到最后剩200ul了，被我加到培养基里倒平板，也是出现很多卫星菌落，我一看就果断换了一管抗生素倒了平板，就好了~~~
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3楼2012-04-01 15:46:09
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wxy1989714

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
天鸟: 金币+1 2012-04-01 16:10:15
连接时间是不是短了点？16度才连3小时
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树叶飞舞，火之意志。
4楼2012-04-01 15:50:57
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