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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】连接转化时遇到的奇怪问题 求解
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jerrity

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】连接转化时遇到的奇怪问题 求解

pcr片段胶回收后，双酶切，直接连接一个用同样的两种酶切的载体，转化感受态细胞JM109，在含卡那霉素的板上长出6个菌落，提质粒发现没有质粒，求解
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1楼 2010-12-06 15:06:10
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feng__

金虫 (著名写手)
重新来····
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2楼2010-12-06 15:20:24
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jerrity

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by feng__ at 2010-12-06 15:20:24:
重新来····

已经做了两次了 想不明白 为什么没有治理 还有抗性
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3楼2010-12-06 15:21:44
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magy2006

木虫 (著名写手)
★
dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-12-06 15:50:07
jerrity(金币+1): 2010-12-06 20:43:37
长出来的是杂菌，很正常，如果长出的都是阳性菌，何须检测？随便挑一个用就是了！
你的问题应该出在回收产物上（有没有回收到？）或者是转化上（热激？电击？），只要酶切的不错，总会长出来的，努力吧
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4楼2010-12-06 15:37:28
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dhmdddd

木虫 (正式写手)
★
dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-12-06 15:50:16
jerrity(金币+1): 2010-12-06 20:43:46
jerrity(金币+2): 2011-04-25 18:47:35
假阳性了，pcr产物直接酶切的效果总是不是很好，试试连到T载体上面再酶切吧，效果很好的！
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5楼2010-12-06 15:43:25
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xuqingchun33

银虫 (小有名气)
jerrity(金币+1): 2010-12-06 20:50:29
做个阳性和阴性对照看看
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6楼2010-12-06 16:07:14
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rainwander

铁杆木虫 (知名作家)
★ ★
amisking(金币+2):鼓励交流！ 2010-12-06 19:10:00
jerrity(金币+1): 2010-12-06 20:44:00
以前做实验的时候，也遇到过这种情况，转化在抗性平板上也长了很多菌落，但是就是提不出质粒。卡在这一步好长时间，最后也稀里糊涂的就解决了。
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7楼2010-12-06 16:40:03
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susizheng

木虫 (著名写手)
换个质粒盒子试试。
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8楼2010-12-06 17:14:01
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zjzz

木虫 (正式写手)
jerrity(金币+1): 2010-12-06 20:44:15
jerrity(金币+1): 2011-04-25 18:47:15
还是连了T载体再做后续实验好
磨刀不误砍材功，欲速则不达
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9楼2010-12-06 20:18:53
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jerrity

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by magy2006 at 2010-12-06 15:37:28:
长出来的是杂菌，很正常，如果长出的都是阳性菌，何须检测？随便挑一个用就是了！
你的问题应该出在回收产物上（有没有回收到？）或者是转化上（热激？电击？），只要酶切的不错，总会长出来的，努力吧

回收产物 跑电泳了 没问题，用热激，42℃ 90s；杂菌也就算了，关键它还有抗性，这就让我想不明白了
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10楼2010-12-06 20:48:04
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lulu1986

捐助贵宾 (小有名气)
jerrity(金币+1): 2010-12-06 21:07:06
首先，须验证，感受态细胞JM109是否染菌，更重要的是否本身带有具卡那抗性的杂菌；
然后，提不出质粒，并不一定代表没有，建议设计载体的通用引物或者用特定片段的特定引物，进行菌落PCR，这样会更加准确；
另外，建议进行亚克隆，即先连接T载体，然后双酶切，建议进行胶回收，如果直接回收，须PCR验证保证质粒已经完全酶切。
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11楼2010-12-06 20:55:56
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jerrity

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2010-12-06 17:14:01:
换个质粒盒子试试。

应该不是质粒盒的问题，我同一批提的别的菌 都有
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12楼2010-12-06 21:01:19
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lulu1986

捐助贵宾 (小有名气)
jerrity(金币+1): 2010-12-07 09:44:54
逐个环节验证吧，总会找到原因的！祝成功！
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13楼2010-12-06 21:42:02
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