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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 转化遭遇红霉素对大肠杆菌失效！
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cicilyok

新虫 (初入文坛)

[求助] 转化遭遇红霉素对大肠杆菌失效！已有1人参与

各位同学：
       我现在准备将表达载体pMG36e转入大肠杆菌，转化之后平板(红霉素终浓度250ug/ml)上长满菌（现象如抗生素失效一样），但是红霉素配好之后是经过验证有效的。从转化平板上挑起来的菌转入液体培养基（红霉素终浓度200ug/ml），12小时不长，24小时就长。我已经卡在这一步很久了，望大家不吝赐教~~~感激不尽！
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1楼2011-10-17 00:15:40
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫之有关部门负责人
★
zhang8826857(金币+1): 鼓励积极回帖^_^ 2011-10-17 09:04:21
换载体
用pET系列的
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小木虫之有关部门负责人
2楼2011-10-17 01:16:22
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hkfgwww

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
zhang8826857(金币+1): 鼓励积极回帖交流^_^ 2011-10-17 22:24:22
cicilyok(金币+2): 我也正准备试试 2011-10-19 09:27:46
大肠杆菌本身就能抗很高的红霉素，要不做个梯度试试看，还有红霉素的稳定性如何？
我就偶尔做过，你查查相关文献吧。
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微生物发酵
3楼2011-10-17 19:47:32
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cicilyok

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by scelab at 2011-10-17 01:16:22:
换载体
用pET系列的

我用pMG36e是因为下一步要转乳酸菌做表达，所以载体不能换吧
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4楼2011-10-19 09:29:16
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若溪

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
scelab(金币+5): 不错的建议 2011-10-19 12:59:35
cicilyok(金币+2): PCR验证过没有条带 2011-10-19 21:26:53
你可以不通过单纯验证抗性来鉴定转化子。12小时不长，24小时长可能是抗生素长时间失效，或是抗生素浓度只是达到抑制其生长，16小时左右就会长起来。你可以把你弄出来的转化子提取质粒，或是跑个PCR，验证一下，应该比单纯依据抗性来判断要准确
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没有比脚更长的路，没有比人更高的山
5楼2011-10-19 10:47:54
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9921218

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
1楼: Originally posted by cicilyok at 2011-10-17 00:15:40:
各位同学：
       我现在准备将表达载体pMG36e转入大肠杆菌，转化之后平板(红霉素终浓度250ug/ml)上长满菌（现象如抗生素失效一样），但是红霉素配好之后是经过验证有效的。从转化平板上挑起来的菌转入液体培养 ...

近来在做 构建工作  载体是乳酸菌表达载体Pmg36e,大小约3700bp,目的片段大小约2600.载体用Sma1和HindⅢ双酶切，目的片段用HindⅢ和EcoRⅤ双酶切。连接体系做的是1ul载体   9ul目的片段  连接酶10ul.连接酶用的是宝生物的Solution。连接16小时候转化大肠杆菌感受态细胞。挑取单克隆做菌液PCR,总是得不到阳性克隆。经常都是空载体。
想到你可能已经解决了，求指点！！！
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七彩泡泡
6楼2012-01-10 13:26:04
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元雪浈

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

那你可能是连接没做好，建议连接后用PCR验证下，在做转化
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祝各位虫友实验顺利！
7楼2012-08-30 10:14:22
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爱莫若月

木虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
8楼2012-08-30 18:24:32
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爱莫若月

木虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
9楼2012-08-30 18:25:16
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water9yoyo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 9921218 at 2012-01-10 13:26:04
近来在做 构建工作  载体是乳酸菌表达载体Pmg36e,大小约3700bp,目的片段大小约2600.载体用Sma1和HindⅢ双酶切，目的片段用HindⅢ和EcoRⅤ双酶切。连接体系做的是1ul载体   9ul目的片段  连接酶10ul.连接酶用的是宝 ...

我和你出现相同情况，你的问题最后是怎么解决的
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成功靠自己
10楼2013-06-14 15:54:37
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