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zeroon

木虫 (正式写手)

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[求助] 关于连接、转化、挑取单克隆的问题已有3人参与

情况是这样的。以puc19为载体，在其多克隆位点插入一个片段，转化后挑取单克隆验证。在平板上挑取了将近100个单菌，才找到一个正确插入了外援片段的。有没有方法能更快更好的选择出来那些真正有插入片段的啊？
毕竟在连接的时候，多克隆位点那里会产生自连，到不是因为没有去磷酸化，因为多克隆位点双酶切后去磷酸化也没用啊，两种酶切，一个是kpn1，另一个是xho1。
上面是第一个问题。

第二个问题是，挑出了一个单克隆，放小瓶培养后，送样测序，结果返回的结果是非单克隆现象。也就是说，小瓶培养的菌里面有转入puc19质粒的，因为都能在amp抗性培养基里生长。现在没法子，只好继续在amp固体培养基筛选挑单菌了。问题来了，有没有更简单的方法快速挑出转化子呢？

第三个问题属于延伸类，有没有可能在转化的时候，puc19和puc19+目的片段，这两种质粒一起转入一个大肠杆菌中，这样一个菌里面，有两种质粒，那这怎么样都没法挑出单克隆来了，对不对？

问题不难，拜托各位大神了，小弟在此谢过了！

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1楼 2015-04-01 17:27:31

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tsingo

金虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-04-02 10:41:36
zeroon: 金币+1, ★有帮助 2015-04-02 18:28:35

1：首先检查你的酶是否失活，如果一个酶失活，目的片段肯定连接不上。
2：转化的筛选有个比较笨的方法，就是菌落PCR，挑选单克隆为模板做PCR，这样可以在短时间内做大量的筛选。单个菌落只能挑一半，剩下的一半备用；PCR引物最好是载体上的，不然，当你的目的片段基因与你使用的克隆菌株基因同源性比较高时，假阳性比较高。

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