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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 关于连接、转化、挑取单克隆的问题
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zeroon

木虫 (正式写手)

[求助] 关于连接、转化、挑取单克隆的问题已有3人参与

情况是这样的。以puc19为载体，在其多克隆位点插入一个片段，转化后挑取单克隆验证。在平板上挑取了将近100个单菌，才找到一个正确插入了外援片段的。有没有方法能更快更好的选择出来那些真正有插入片段的啊？
毕竟在连接的时候，多克隆位点那里会产生自连，到不是因为没有去磷酸化，因为多克隆位点双酶切后去磷酸化也没用啊，两种酶切，一个是kpn1，另一个是xho1。
上面是第一个问题。

第二个问题是，挑出了一个单克隆，放小瓶培养后，送样测序，结果返回的结果是  非单克隆现象。 也就是说，小瓶培养的菌里面有转入puc19质粒的，因为都能在amp抗性培养基里生长。现在没法子，只好继续在amp固体培养基筛选挑单菌了。问题来了，有没有更简单的方法快速挑出转化子呢？

第三个问题属于延伸类，有没有可能在转化的时候，puc19和puc19+目的片段，这两种质粒一起转入一个大肠杆菌中，这样一个菌里面，有两种质粒，那这怎么样都没法挑出单克隆来了，对不对？

问题不难，拜托各位大神了，小弟在此谢过了！
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1楼2015-04-01 17:27:31
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王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zeroon: 金币+15, ★★★很有帮助, 谢谢 2015-04-01 23:21:10
zeroon: 金币+5, ★有帮助, 看到小哥头像很帅，再加5分 2015-04-01 23:38:57
第一个问题：双酶切一般假阳性率很低的，载体双酶切后回收切开的链状载体，目的片段也是双酶切，然后连接转化，一般能在抗性平板上生长的绝大部分都是阳性克隆的，如果只是为了测序，建议使用TA克隆，要想快速筛的阳性克隆可以外加蓝白斑筛选；
第二个问题：挑菌斑的时候绝对挑取单菌落，挑取不同菌斑避免交叉污染，一般不会出现非单克隆现象的，同样的要快速挑出转化子。可以做蓝白斑筛选；
第三个问题：质粒具有排异性，一般一个细菌细胞只能转化一种质粒，类似于受精过程，一个卵细胞只接受一个精子，当然也有些专门用作转化多个质粒的工程质粒和工程菌除外。

个人见解
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没有做不到，只有想不到！
2楼2015-04-01 17:57:48
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zeroon: 金币+5, ★有帮助, 谢谢 2015-04-01 23:30:18
一般一个培养皿跳10个就可以了，十个没有就基本肯定没连上，去磷酸化对你这个实验是可行的，什么是去磷酸化，就是让质粒的5端失效，质粒的5失效了它就一定无法自连了。                                     2，用T载体连是最有效的，你的引物上带了酶切位点，连上后直接切就行了。     3同上。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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采菊东篱下，悠然见南山。
3楼2015-04-01 18:13:06
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tsingo

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-04-02 10:41:36
zeroon: 金币+1, ★有帮助 2015-04-02 18:28:35
1：首先检查你的酶是否失活，如果一个酶失活，目的片段肯定连接不上。
2：转化的筛选有个比较笨的方法，就是菌落PCR，挑选单克隆为模板做PCR，这样可以在短时间内做大量的筛选。单个菌落只能挑一半，剩下的一半备用；PCR引物最好是载体上的，不然，当你的目的片段基因与你使用的克隆菌株基因同源性比较高时，假阳性比较高。
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4楼2015-04-02 09:40:53
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