应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切酶连转化后单克隆检测不对
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
91/1返回列表
查看: 1759  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

fxj1986

木虫 (正式写手)

[交流] 酶切酶连转化后单克隆检测不对

自己构建的载体，片段7K左右；片段（3k）通过PCR扩增；电泳后回收进行酶切，酶切条件37℃，3h；再电泳后回收，酶连时载体：片段=1:1.5左右，转化DH5α，16h（氯霉素抗性）平板上单克隆很多；挑取单克隆进行菌落PCR验证（引物为自己设计），电泳结果显示除了目的条带外还有其他条带；对单克隆培养重新提取质粒进行双酶切后，只检测出一条带（与质粒大小基本一致），没有片段的目的条带。几次转化都如此，求分析，求经验！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2012-10-12 15:52:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kk26

木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fxj1986: 金币+1, 谢谢，同勉 2012-10-12 22:34:40
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-13 16:30:16
做过以未连入片段的质粒为模板的阴性对照PCR吗？怀疑你没有连入片段，pcr筛菌出来的并非阳性克隆。

我目前也筛不到阳性克隆，同样郁闷，继续做做！
同祝好运！
赞一下 回复此楼
2楼2012-10-12 17:28:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

酶切专家

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fxj1986: 金币+3, 谢谢 2012-10-12 22:35:36
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-13 16:30:30
应该是载体酶切不完全（没有完全进行双酶切）。不知道你用的是什么酶。不同酶的用量会差5-30倍。你可以用double digestion designer设计你的酶切实验，确保载体酶切完全，基本没有背景克隆。你可以在小木虫上搜到的。祝好运。
赞一下 回复此楼
3楼2012-10-12 20:32:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

faile18

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fxj1986: 金币+1, 引物是一样的，正在改变酶切条件 2012-10-13 10:26:32
小丹木木: 金币+3, 光路交流 2012-10-13 16:30:40
小丹木木: 操作失误，不好意思 2012-10-13 16:31:02
有点疑问，也有点小建议：
1. 可以考虑蓝白斑筛选，初步滤掉空载体，白色克隆PCR检测，（这里有个疑问，你PCR验证时说引物自己设计，不知道你这对引物与你之前PCR扩增3K片段时是否一样，如果不一样可以考虑用那对引物扩增来检测一下）。
2. 确定下质粒双酶切体系是否兼容，比如buffer，酶用量等都会有影响。
3. 你的载体自身是否work？
祝好运。
赞一下 回复此楼
4楼2012-10-13 04:15:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fxj1986: 金币+1 2012-10-13 10:26:43
首先确保用的两个酶没问题。酶切完用碱性磷酸酶处理载体减少自连。菌落PCR时做负对照。
赞一下 回复此楼
5楼2012-10-13 08:41:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

j2

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fxj1986: 金币+1, 谢谢，正在调整比例 2012-10-13 10:27:03
载体本身也有抗性？还是抗生素失效？
可以考虑增大连接时目的基因的量
赞一下 回复此楼
6楼2012-10-13 09:37:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zqp9110

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-10-13 16:31:14
fxj1986: 金币+1, 谢谢建议 2012-10-14 10:23:43
连接时插入片段和载体的比例可能要大一点才能增加连接效率吧。建议连接结束后把连接产物先进行电泳检测，看是否有插入了目的片段的完整载体，每一步都加入质控能减少不必要的工作量。
赞一下 回复此楼
7楼2012-10-13 10:46:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

20083630zhan

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by zqp9110 at 2012-10-13 10:46:44
连接时插入片段和载体的比例可能要大一点才能增加连接效率吧。建议连接结束后把连接产物先进行电泳检测，看是否有插入了目的片段的完整载体，每一步都加入质控能减少不必要的工作量。

这样也可以吗？连接产物本来就非常少，电泳能看出条带吗？
赞一下 回复此楼
8楼2014-03-03 16:08:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
酶连时载体：片段=1:1.5？？？？我们一般是载体：片段的摩尔数=1:3~1:10.
赞一下 回复此楼
9楼2014-03-03 17:12:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 fxj1986 的主题更新
91/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 085602 307分 求调剂 +6 不知道叫什么！ 2026-03-26 6/300 2026-03-27 22:00 by 催化大白
[考研] 295求调剂 +4 1428151015 2026-03-27 5/250 2026-03-27 19:53 by JourneyLucky
[考研] 0703化学 +6 妮妮ninicgb 2026-03-27 6/300 2026-03-27 17:18 by shangxh
[考研] 283求调剂（080500） +4 A child 2026-03-27 4/200 2026-03-27 15:34 by XPU李庆
[考研] 0703一志愿9，初试成绩：338，四六级已过，有科研经历，求调剂！ +3 Zuhui0306 2026-03-25 3/150 2026-03-27 14:09 by shangxh
[考研] 312求调剂 +9 上岸吧ZJY 2026-03-22 13/650 2026-03-27 11:24 by sanrepian
[考研] 一志愿郑大085600，310分求调剂 +5 李潇可 2026-03-26 5/250 2026-03-27 11:14 by 不吃魚的貓
[论文投稿] Journal of Mechanical Science and Technology +3 Russ_ss 2026-03-25 5/250 2026-03-27 10:49 by 陆小果画大饼
[考研] 081200-11408-276学硕求调剂 +4 崔wj 2026-03-26 4/200 2026-03-27 08:04 by chemisry
[硕博家园] 招收生物学/细胞生物学调剂 +3 IceGuo 2026-03-26 4/200 2026-03-27 05:35 by user003
[考研] 材料调剂 5+4 想要一壶桃花水 2026-03-25 10/500 2026-03-26 19:56 by 不吃魚的貓
[考研] 机械学硕310分，数一英一，一志愿211本科双非找调剂信息 +3 @357 2026-03-25 3/150 2026-03-26 16:34 by by.MENG
[考研] 334分 一志愿武理 材料求调剂 +4 李李不服输 2026-03-26 4/200 2026-03-26 16:00 by 不吃魚的貓
[考研] 347求调剂 +4 L when 2026-03-25 4/200 2026-03-25 13:37 by cocolv
[考研] 080500求调剂 +3 zzzzfan 2026-03-24 3/150 2026-03-24 16:38 by barlinike
[考研] 305分求调剂（食品工程） +5 Sxy112 2026-03-21 7/350 2026-03-24 12:27 by 544594351
[考研] 一志愿国科过程所081700，274求调剂 +3 三水研0水立方 2026-03-23 3/150 2026-03-23 23:11 by MajorWen
[考研] 269求调剂 +4 我想读研11 2026-03-23 4/200 2026-03-23 21:25 by pswait
[考研] 一志愿东华大学控制学硕320求调剂 +3 Grand777 2026-03-21 3/150 2026-03-21 19:23 by 简之-
[考研] 求调剂 +4 要好好无聊 2026-03-21 4/200 2026-03-21 18:57 by 学员8dgXkO
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭