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fxj1986

木虫 (正式写手)

应助: 7 (幼儿园)
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帖子: 948
在线: 264.8小时
虫号: 721183

[交流] 酶切酶连转化后单克隆检测不对

自己构建的载体，片段7K左右；片段（3k）通过PCR扩增；电泳后回收进行酶切，酶切条件37℃，3h；再电泳后回收，酶连时载体：片段=1:1.5左右，转化DH5α，16h（氯霉素抗性）平板上单克隆很多；挑取单克隆进行菌落PCR验证（引物为自己设计），电泳结果显示除了目的条带外还有其他条带；对单克隆培养重新提取质粒进行双酶切后，只检测出一条带（与质粒大小基本一致），没有片段的目的条带。几次转化都如此，求分析，求经验！

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1楼 2012-10-12 15:52:01

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zqp9110

金虫 (正式写手)

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虫号: 997891

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-10-13 16:31:14
fxj1986: 金币+1, 谢谢建议 2012-10-14 10:23:43

连接时插入片段和载体的比例可能要大一点才能增加连接效率吧。建议连接结束后把连接产物先进行电泳检测，看是否有插入了目的片段的完整载体，每一步都加入质控能减少不必要的工作量。

7楼2012-10-13 10:46:44

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