24小时热门版块排行榜    

查看: 1940  |  回复: 5

zpsl1986

新虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切转化之后不长菌

求助大家,我构建载体,用的BamHI 和XbaI双酶切,载体大小10000bp,基因大小1000bp,酶切连接之后转化,转化几次都不长菌,做的对照正常,说明转化没有问题,平板的抗性也没问题,看网上说XbaI受甲基化影响,我用的是top10的大肠杆菌感受态,不知道跟甲基化有什么关系。希望大家给分析一下!不胜感激!
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

oylb

禁言 (正式写手)

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-04 16:04:06
本帖内容被屏蔽

2楼2013-11-04 11:32:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zpsl1986

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by oylb at 2013-11-04 11:32:01
应该是连接效率的问题,或者其他的潜在可能,比如PCR产物是否为目的片段(有可能为假阳性)、PCR产物末端的保护碱基是否合适,等等。

我以前用过这个载体,也出现这样的问题,当时一个板上就长了那一个菌,结果还是阳性。连接效率问题的话,多加点连接酶可以吗?
3楼2013-11-04 15:27:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

eulota

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-07 16:41:46
我最近正好刚刚用这两个酶做双酶切连接构建,一切很顺利,几乎都是阳性克隆。
我用的是酶是NEB的。lz说的比较含糊,这个是常规技术,双酶切连接理论上成功率是相当高的。没有太多可说的,2个建议仅供参考:
1. 酶切问题,你是怎么得到酶切处理后的片段和载体的呢?如何确保你得到酶切处理成功了呢?双酶切的缓冲液是否正确呢?
2.连接问题,你是如何做的连接反应呢?是否可改进?比如4度过夜,或者16度超过4小时?
4楼2013-11-07 09:40:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shanqian1988

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-07 16:41:55
估计连接酶的问题吧,我遇到过这种情况,换连接酶就好啦
5楼2013-11-07 10:13:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

董淑浩

银虫 (小有名气)

建议你连接t载体之后再做看看。
好好努力
6楼2013-11-07 10:15:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 zpsl1986 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章,我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 5/250 2026-08-23 07:41 by OEbVnUOu01ol
[考博] 售SCI一区T0P文章,我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-21 10/500 2026-08-23 07:17 by OEbVnUOu01ol
[论文投稿] 售SCI一区文章,我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 4/200 2026-08-23 04:04 by OEbVnUOu01ol
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章,我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 7/350 2026-08-23 03:55 by OEbVnUOu01ol
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章,我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 6/300 2026-08-23 03:40 by OEbVnUOu01ol
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章,我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 QTy3jDtz1uLt 2026-08-21 11/550 2026-08-23 02:55 by OEbVnUOu01ol
[考博] 售SCI文章,我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 DpSrDtM079iu 2026-08-22 3/150 2026-08-23 00:55 by OEbVnUOu01ol
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +3 zjuhero 2026-08-22 4/200 2026-08-22 20:02 by mycsru
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +24 yaoyewhu2008 2026-08-20 26/1300 2026-08-22 17:43 by kammury
[基金申请] filecode,4个jtjc了 +13 ziyangfang 2026-08-19 16/800 2026-08-22 17:08 by WH3796
[基金申请] 科研孤儿太难了 +17 我4大白菜 2026-08-20 18/900 2026-08-21 20:57 by zhangev
[基金申请] 时间戳又变了 +13 wuchongjun 2026-08-20 19/950 2026-08-21 17:21 by 紫杉醇
[基金申请] 让我中一个面上吧! +11 大萍1987 2026-08-20 13/650 2026-08-21 14:48 by 20120902066
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +7 angus9576 2026-08-17 12/600 2026-08-21 13:38 by weiyin
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧? +4 哈哈蛤? 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
[基金申请] 基金啊基金 +4 longfie172 2026-08-20 4/200 2026-08-21 08:58 by mark mao
[基金申请] 估计是周四 +3 archvillain 2026-08-18 3/150 2026-08-21 01:48 by jnhyjjm
[基金申请] 今天系统多次维护,明天很可能放榜! +10 zju2000 2026-08-16 11/550 2026-08-20 20:02 by cl479861084
[基金申请] 重要消息,中午系统在维护 +11 yuleib84 2026-08-18 12/600 2026-08-20 11:09 by xskun
[基金申请] 今天放榜吗? +14 布布和一二 2026-08-19 15/750 2026-08-19 18:07 by gltch
信息提示
请填处理意见