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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切转化之后不长菌
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zpsl1986

新虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切转化之后不长菌

求助大家，我构建载体，用的BamHI 和XbaI双酶切，载体大小10000bp，基因大小1000bp，酶切连接之后转化，转化几次都不长菌，做的对照正常，说明转化没有问题，平板的抗性也没问题，看网上说XbaI受甲基化影响，我用的是top10的大肠杆菌感受态，不知道跟甲基化有什么关系。希望大家给分析一下！不胜感激！
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1楼 2013-11-04 10:48:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

oylb

禁言 (正式写手)
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-04 16:04:06
本帖内容被屏蔽
2楼2013-11-04 11:32:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zpsl1986

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by oylb at 2013-11-04 11:32:01
应该是连接效率的问题，或者其他的潜在可能，比如PCR产物是否为目的片段（有可能为假阳性）、PCR产物末端的保护碱基是否合适，等等。

我以前用过这个载体，也出现这样的问题，当时一个板上就长了那一个菌，结果还是阳性。连接效率问题的话，多加点连接酶可以吗？
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3楼2013-11-04 15:27:57
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eulota

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-07 16:41:46
我最近正好刚刚用这两个酶做双酶切连接构建，一切很顺利，几乎都是阳性克隆。
我用的是酶是NEB的。lz说的比较含糊，这个是常规技术，双酶切连接理论上成功率是相当高的。没有太多可说的，2个建议仅供参考：
1. 酶切问题，你是怎么得到酶切处理后的片段和载体的呢？如何确保你得到酶切处理成功了呢？双酶切的缓冲液是否正确呢？
2.连接问题，你是如何做的连接反应呢？是否可改进？比如4度过夜，或者16度超过4小时？
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4楼2013-11-07 09:40:32
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shanqian1988

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-07 16:41:55
估计连接酶的问题吧，我遇到过这种情况，换连接酶就好啦
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2013-11-07 10:13:13
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董淑浩

银虫 (小有名气)
建议你连接t载体之后再做看看。
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好好努力
6楼2013-11-07 10:15:23
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