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qfbushizi2008

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[求助] 双酶切连接转化后貌似出现自连

我想克隆一个基因到表达载体PGEX-6P-2，该质粒大小5000，我的目的基因3000左右，连接前酶切产物检测了，大小正确，练接转化后，挑克隆，提取质粒，并单酶切检测大小，竟然是5000左右，感觉像自连，但双酶切应该不会发生自连，我用的两个酶是EcoI 和Not I，PCR扩增也没出来，如果没连上，应该菌不会找。求分析愿意，哪的问题，想了半天找不出来，谢谢！见图；第二个图，第一个带，是质粒双酶切，2为，目的基因双酶切，3转化后，挑克隆，提取质粒单酶切，4是22000的Marker

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1楼2013-06-13 11:55:17

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cicelyzh

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【答案】应助回帖

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qfbushizi2008: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-06-13 13:26:01
myprayer: 金币+1, Send one rose fragrance in hand, thank you loosen one's purse strings generously, look forward to your wonderful 2013-06-13 13:40:00

载体自连说明双酶切载体时酶切不完全，虽然切成线性分子，但是载体双酶切的带和单酶切的带几乎一样大，很难分辨的。你的情况很可能是其中的一个酶切得不好。你做双酶切载体的同时最好分别做两个酶的单酶切对照，酶的用量要根据酶活性和质粒的用量来加。